SEARCH

Search Details

Fujita Masaki J

Faculty of Fisheries Sciences　Marine Life Science　Marine Bioresources ChemistryAssociate Professor

http://www.cris.hokudai.ac.jp/fujita/index.html/

HPです。今後充実させていきます。

Researcher basic information

■ Degree
  • 博士（農学）, 東京大学大学院農学生命科学研究科
■ URL
researchmap URLホームページURL■ Various IDs
J-Global ID■ Research Keywords and Fields
Research Keyword
  • 環境細菌
  • クオラムセンシング
  • アオコ
  • 赤潮
  • 魚醤
  • シデロフォア
  • 海洋生物資源
  • 海洋天然物
  • 生物有機化学
  • 異宿主生産
  • 生合成遺伝子
  • メタゲノム
  • 生理活性物質
Research Field
  • Life Science, Aquatic life science, 水圏天然物化学
  • Nanotechnology/Materials, Chemistry and chemical methodology of biomolecules
  • Life Science, Pharmaceutical chemistry and drug development sciences
■ Educational Organization

Career

■ Career
Career
  • 2012 - Present
    Hokkaido University, 水産科学研究院, その他
  • Jan. 2008 - Nov. 2011
    Kumamoto University, School of Pharmacy
Educational Background
  • Apr. 1998 - Mar. 2003, 東京大学大学院, 農学生命科学研究科, 水圏生物科学専攻
Committee Memberships
  • Apr. 2025 - Present
    日本水産学会, 編集委員会, Society
  • Feb. 2021 - Present
    日本水産学会, 企画広報委員会, Society
  • Feb. 2015 - Present
    日本水産学会, 水産学若手の会, Society

Research activity information

■ Papers
■ Other Activities and Achievements
  • メタゲノム由来新規オートインデューサー様物質の生理活性
    新村樹; 三輪俊太; 酒井隆一; 藤田雅紀; 木村信忠, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021
  • メタゲノム由来新規オートインデューサー様物質の生産と同定
    伊藤秀輝; 酒井隆一; 藤田雅紀; 木村信忠, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021
  • Pseudomonas属アオコ殺藻細菌および活性物質の野生藻類に対する影響
    陳樹河; 酒井隆一; 藤田雅紀; 今井一郎, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021
  • メタボロミクスを用いた藻類と殺藻細菌の共培養系における活性物質の探索
    羽賀美優; 今井一朗; 酒井隆一; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021
  • 海綿-シアノバクテリア共生系由来新規糖代謝物の単離・構造解析
    野口祐輔; 小田悠太; 張権; 藤田雅紀; 酒井隆一, 日本水産学会北海道支部大会講演要旨集, 2020 (CD-ROM), 2020
  • Alteromonas属殺藻細菌由来シデロフォアの同定と機能解析
    神手大輝; 酒井隆一; 藤田雅紀; 今井一郎, 日本水産学会大会講演要旨集, 2019, 2019
  • カイメン（海綿）に共生する製薬工場
    生物工学, 96, 10, 593, 593, Oct. 2018, [Invited], [Lead author, Corresponding author]
  • Alteromonas属由来の殺藻物質の生産と殺藻様式に関する研究
    梅津早希; 今井一郎; 酒井隆一; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集, 2017, 102, 26 Mar. 2017
    Japanese
  • アオコ原因種Microcystis aeruginosaに対する殺藻細菌の殺藻機構におけるクオラムセンシング関与の可能性
    大洞裕貴; 宮下洋平; 小林淳希; 小峯佳奈子; 藤田雅紀; 酒井隆一; 織田さやか; 田中邦明; 今井一郎, 日本陸水学会大会講演要旨集, 82nd (Web), 2017
  • カリブ海産ホヤTrididemnum solidumに含まれる抗腫瘍性化合物didemnin類の産生について
    市森大地; 藤田雅紀; 今田千秋; 酒井隆一, 日本水産学会大会講演要旨集, 2016, 116, 26 Mar. 2016
    Japanese
  • Alteromonas属海洋細菌由来の赤潮殺藻物質
    梅津早希; 今井一郎; 酒井隆一; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集, 2016, 113, 26 Mar. 2016
    Japanese
  • 西表島産Spongosorites属海綿に含まれるタンパク質毒素の分離
    酒井隆一; 中野宏治; 上田拓也; 北野雅也; 小野巧; 棚野豪太; 神保充; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集, 2016, 2016
  • Algicidal Compounds from Alteromonas sp.
    Umetsu Saki; Imai Ichiro; Sakai Ryuichi; Fujita Masaki, Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers, 58, 0, Poster32, 2016

    Utilization of algicidal bacteria is expected as a new method to prevent red-tide, a harmful algal blooming, which causes serious damage on fisheries industry and also marine animals. However, algicidal molecules produced by marine bacteria are hardly known. In this study, we present isolation, structure elucidation and biological activity of algicidal phenoxazinon derivatives including three novel compounds.

    Four deep-yellow pigments (1-4) were purified as main algicidal molecules from a culture broth of Alteromonassp. strain D which isolated from red-tide blooming sea water around Hiroshima-bay. Structures were determined based on spectroscopic analysis along with comparison with literature data as 2-aminophenoxazin-3-on (APO, 1) and its derivatives.

    Compound 1 and 2 showed algicidal activity against Chattnella antiquawhich is one of the red-tide forming phytoplankton with LD50 values of 0.29 and 0.23 mg/mL, respectively. However, compound 1was less toxic against other marine organisms including macro-alga, Bangia fuscopurpurea, and crustacean, Artemia salina, with LD50 values of 4.0 and 7 mg/mL.

    , Symposium on the Chemistry of Natural Products Steering Committee, Japanese
  • 海綿・ホヤに共生する藍藻のケミカルバイオロジー
    SAKAI RYUICHI; ICHIMORI DAICHI; ODA YUTA; FUJITA MASAKI; IMADA CHIAKI, マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集, 17th, 51, 30 May 2015
    Japanese
  • Mellpaladines, novel neuroactive compounds from a Palauan Didemnidae tunicate
    Uchimasu Hajime; Matsumura Ken; Tsuda Masashi; Kumagai Keiko; Akakabe Mai; Fujita M.J.; Sakai Ryuichi, Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers, 57, 0, PosterP31, 2015

    Various ionotropic receptors, metabotropic receptors and ion channels in the central nervous system play key roles in neurotransmission and homeostasis. We have been searching for neuroactive compounds interacting with these receptors or ion channels from aqueous extracts of marine benthic organisms including sponges and tunicates. Recently, we found that the extract of a Palauan Didemnidae tunicate suppressed voluntary behaviors in mice after intracerebroventricular administration. A bioassay-guided separation resulted in isolation of novel 3,4-dihydroisoquinoline alkaloids, dopargimine（1）and mellpaladines A-F（2-7）. Moreover, 4-guanidino butyric acid （8） and polysulfur alkaloid lissoclibadins（9）were also identified from this specimen. The structures of 1-7 and a known 8, 9 were assigned on the basis of spectroscopic data and chemical reactions.

    Biological targets for 1-3 were screened by binding assays using 43 neuronal receptors and transporters. Functions of those compounds for high affinity receptors were also evaluated. 1 showed affinity for d-opioid receptor and determined to be an agonist. 2and 3 showed high affinity for three subtypes（5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT5A）of serotonin receptors and shown to be a potent antagonists for 5-HT5A.

    , Symposium on the Chemistry of Natural Products Steering Committee, Japanese
  • 海洋メタゲノムからの未知シデロフォア生合成遺伝子のクローニングと異宿主生産
    藤田雅紀; 時田学幸; 石川高史; 酒井隆一, 日本水産学会大会講演要旨集, 2014, 121, 27 Mar. 2014
    Japanese
  • Cloning and Heterologous Expression of the Agrobactin Biosynthetic Gene Cluster from a Marine Metagenome
    Fujita Masaki; Tokita Takayuki; Ishikawa Takafumi; Sakai Ryuichi, Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers, 56, 0, Poster55, 2014

    A biosynthetic gene cluster of unknown siderophore was cloned from a metagenomic library constructed from a marine sponge by function based screening method. Sequencing of the cloned DNA revealed presence of a putative biosynthetic gene cluster consisted of 15 ORFs which showed similarity to vibriobactin biosynthetic gene cluster from Vibrio cholera.

    Culture broth of the siderophore producing clone exhibited characteristic mass peak at m/z 637 which rack in the negative clone. The crude extract of the broth was fractionated by repetitive column chromatography guided by mass signal. The product was finally purified by HPLC as hexamethyl derivative. Structure of the methylated product was determined by combination of spectroscopic analysis as well as speculation from biosynthetic information to be a hexamethyl agrobactin suggested that the original product was agrobaction which has been reported from a terrestrial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens.

    It was the first report of agrobaction from marine environmental samples and also the first heterologous production of this class of molecules.

    , Symposium on the Chemistry of Natural Products Steering Committee, Japanese
  • 海洋細菌からの非環状ヒドロキサム酸型シデロフォアの単離と推定生合成遺伝子のクローニング
    藤田雅紀; 中野宏治; 酒井隆一, 日本水産学会大会講演要旨集, 2013, 100, 26 Mar. 2013
    Japanese
  • Cloning and Expression of the Biosynthetic Gene Cluster of Bisucaberin B
    Fujita Masaki; Nakano Koji; Sakai Ryuichi, Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers, 55, 0, PosterP, 56, 2013

    A siderophore, bisucaberin B, was isolated from a bacterium Tenacibaculum mesophilum separated from a marine sponge collected in the Republic of Palau. Using spectroscopic and chemical methods, the structure of bisucaberin B was determined asa linear dimer of N-hydroxy-N-succinyl cadaverine (HSC). To the best of our knowledge, it is the first report of bisucaberin B as a biosynthetic product, and also this compound is the first siderophore found from the bacteria belong to the phylum Bacteroidetes.

    The putative bisucaberin B biosynthetic gene cluster bsbA-E was cloned from a genomic library of T. mesophilum using homology sequence conserved in the known HSC based siderophore biosynthetic genes. It consists of 6 ORFs instead of 4 genes found in the other bacteria. The last HSC condensation gene was duplicated in the bsb cluster, and the additional gene which showed homology with major facilitator superfamily also existed.

    To confirm that the cloned genes were actually responsible for bisucaberin B bioproduction, two candidate enzymes for HSC dimerization, BsbD1 and BsbD2, were co-expressed with MbsA-C which were marine metagenome originated enzymes already confirmed to produce HSC in the E. coli. As a result, only BsbD2 containing recombinant clone produced bisucaberin B efficiently (production yield 16.1 mg/L) suggested that the cloned bsb cluster is bisucaberin B biosynthetic genes, and presence of only BsbD2 is enough for dimerization of HSC.

    , Symposium on the Chemistry of Natural Products Steering Committee, Japanese
  • 線虫C. elegansの耐性幼虫フェロモン フェロモンで寿命が延びる！？モデル生物の化学生態学
    藤田 雅紀, 化学と生物, 46, 7, 442, 443, Jul. 2008, [Invited], [Lead author, Corresponding author]
    Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, Japanese
■ Books and other publications
■ Lectures, oral presentations, etc.
  • Mycale Sponge Inherits Mycalolide Producers Through Vertical Microbial Transmission
    藤田雅紀; 高田健太郎
    2018 Gordon Research Conference marine Natural Products, 08 Mar. 2018, English, Invited oral presentation
    04 Mar. 2018 - 09 Mar. 2018, [Invited]
  • 遺伝子から探す・作る海洋天然物
    藤田雅紀
    日本化学会北海道支部会講演会, 14 Oct. 2016
    [Invited]
  • アカデミックキャリアパス
    藤田雅紀
    第18回マリンバイオテクノロジー学会大会 若手シンポジウム, 28 May 2016
    [Invited]
  • メタゲノム法を用いた海洋天然物化学研究
    藤田雅紀
    2015年度マリンケミカルバイオロジー研究会, 27 Mar. 2015
    [Invited]
  • メタゲノム法を用いた海洋天然物の異宿主生産
    藤田雅紀
    日本農芸化学会東北支部会第13回若手の会, 05 Oct. 2012
  • 海洋天然物の異宿主生産を指向したメタゲノム研究
    藤田雅紀
    第5回札幌微生物生態学セミナー, 03 Aug. 2012
    [Invited]
  • 異宿主発現法を用いた新規抗菌物質Pantocin Cの生産と同定
    藤田雅紀
    第3回万有若手シンポジウム, Nov. 2008
■ Syllabus
  • 生物資源化学特論Ⅱ, 2024年, 修士課程, 水産科学院
  • 一般教育演習(ﾌﾚｯｼｭﾏﾝｾﾐﾅｰ), 2024年, 学士課程, 全学教育
  • 健康と社会, 2024年, 学士課程, 全学教育
  • 環境と人間, 2024年, 学士課程, 全学教育
  • 機器分析化学, 2024年, 学士課程, 水産学部
  • 潜水調査実習, 2024年, 学士課程, 水産学部
  • 有機化学実験, 2024年, 学士課程, 水産学部
■ Affiliated academic society
  • 日本農芸化学会
  • アメリカ化学会
  • 日本化学会
  • 日本水産学会
■ Research Themes
  • Studies toward improvement/acquirement of carotenoid deposition in muscle of white meat fish
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    30 Jun. 2023 - 31 Mar. 2026
    平松 尚志; 東藤 孝; 藤田 雅紀
    本研究では、魚類カロテノイド分解に関わる遺伝子候補に着目し、その翻訳制御機構を解明すると共に、同候補のゲノム編集が身色形質の改善に有効か否かを試すことを目的とする。目的達成に向け、「スカベンジャー受容体クラスBタイプ1（srb1）を介したアスタキサンチン（Ax）取込み量を増やし、βカロテンオキシゲナーゼ（bco）による分解を抑えることができれば、最終的に筋肉のAx蓄積量が増え赤色呈色性が強くなる」と仮説を立て、これを直接的にゲノム編集により実証する課題1と、未知な点が多いsrb1及びbcoの翻訳制御機構を明らかにする課題2を実施する。
    R5年度は、公開ゲノムデータベースを探索し、ニジマスではbco1, bco1l, srb1遺伝子、メダカではbco1とbco1l遺伝子について、各ゲノム上の位置や配列を特定した。この情報を基に、課題1では、各遺伝子のガイドRNA（gRNA）を設計・合成した。これらのgRNAとCas9ヌクレアーゼを用いて、ニジマス及びメダカの受精卵に顕微注入し作出したF0胚について、ヘテロ二本鎖移動度分析（HMA）とシーケンス解析結果、両種ともにbco1lに関しては、変異導入個体が確認できた。一方で、その他の遺伝子については、変異導入個体の作出に至らなかった。課題2に関しては、両種から上記遺伝子転写産物のcDNAクローニングを行い、全てのクローニングを完了した。メダカbco1lについては、組換え蛋白質とその抗体を作製し、抗原組換え蛋白質との免疫陽性反応を得た。この抗体を用いて、消化管試料のウェスタンブロッティングを実施したが、陽性反応は確認できなかった。現在、bco1l以外の遺伝子由来の組換え蛋白質の作製も継続中である。一方、身色の赤色呈色を獲得前の若年魚と同呈色獲得後の出荷魚を用い、消化管におけるmiRNA発現データの取得を行った。
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory), Hokkaido University, 23K18041
  • Studies on metagenome derived novel QS signaling indole derivative
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    30 Jun. 2023 - 31 Mar. 2026
    藤田 雅紀
    微生物は同種細胞密度を感知して様々な機能発現を制御するクオラムセンシング機構(QS)を有する。これまでQSは同種細胞にのみ機能し、異種間の相互作用は認識されていなかった。しかし、我々が見出した新規インドロキナゾリン化合物であるQAI-1は、本来の誘導物質（オートインデューサー、AI）が異なる複数のレポーターアッセイ系において、本来のAI以上のQS活性を示した。また、自身ではAIを生産せず、他者からAIを受容すると考えられるLux-soloと呼ばれる細菌が、環境中細菌の7割を占めると報告されている。そこでQAI-1が多くの菌種に対して普遍的に作用するのであれば、LuxR-soloを含め様々な細菌に対する汎用的な微生物機能誘導剤として利用できるのではと考え、その実現可能性を検討した。
    ①レポーターアッセイによる有効範囲の検討 それぞれC10-AHLとC6-AHLを本来の基質とするC. violaceun VIR24とS. marcescens AS-1に対してQAI-1を作用させたところ、10 pmolの処理でレポーター活性であるviolaceinの産生が認められた。一方でS. marcescens AS-1Δに関しては、約250 nmolのQAI-1添加によってもレポーター活性であるprodigiosinの産生が認められなかった。これまでレポーターアッセイを行った5株の中で、初めて活性を示さないものを見出した。
    ②遺伝子発現スクリーニング法の確立 環境から分離した野生菌株に対する機能発現試験を実施した。野生分離株はどの様な機能がQSで制御されているのかなど全く不明である。そこで、簡便に多検体を試験可能なシデロフォアと抗酸化物質および緑膿菌のQS表現型として知られるバイオフィルム産生試験を確立した。また、150検体を試験したところ73株に何らかの表現型変化が認められた。
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory), Hokkaido University, 23K18040
  • メタゲノムおよびメタボローム解析を用いた実環境での殺藻細菌の機能解明
    科学研究費助成事業
    01 Apr. 2020 - 31 Mar. 2025
    藤田 雅紀; 二階堂 雅人; 木村 信忠
    微生物は同種細胞密度を感知して様々な機能発現を制御するクオラムセンシング機構(QS)を有する。これまでQSは同種細胞にのみ機能し、異種間の相互作用は認識されていなかった。しかし、我々が見出した新規インドロキナゾリン化合物であるQAI-1は、本来の誘導物質（オートインデューサー、AI）が異なる複数のレポーターアッセイ系において、本来のAI以上のQS活性を示した。また、自身ではAIを生産せず、他者からAIを受容すると考えられるLux-soloと呼ばれる細菌が、環境中細菌の7割を占めると報告されている。そこでQAI-1が多くの菌種に対して普遍的に作用するのであれば、LuxR-soloを含め様々な細菌に対する汎用的な微生物機能誘導剤として利用できるのではと考え、その実現可能性を検討した。
    ① レポーターアッセイによる有効範囲の検討 それぞれC10-AHLとC6-AHLを本来の基質とするC. violaceun VIR24とS. marcescens AS-1に対してQAI-1を作用させたところ、10 pmolの処理でレポーター活性であるviolaceinの産生が認められた。一方でS. marcescens AS-1Δに関しては、約250 nmolのQAI-1添加によってもレポーター活性であるprodigiosinの産生が認められなかった。これまでレポーターアッセイを行った5株の中で、初めて活性を示さないものを見出した。
    ② 遺伝子発現スクリーニング法の確立 環境から分離した野生菌株に対する機能発現試験を実施した。野生分離株はどの様な機能がQSで制御されているのかなど全く不明である。そこで、簡便に多検体を試験可能なシデロフォアと抗酸化物質および緑膿菌のQS表現型として知られるバイオフィルム産生試験を確立した。また、78検体を試験したところ35株に何らかの表現型変化が認められた。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23K20290
  • メタゲノムおよびメタボローム解析を用いた実環境での殺藻細菌の機能解明
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    01 Apr. 2020 - 31 Mar. 2025
    藤田 雅紀; 木村 信忠; 二階堂 雅人
    ① 同定した殺藻細菌および殺藻物質の実環境での機能解析 Pseudomonas属殺藻細菌をモデルとし、アオコ原因藻類との共培養により産生誘導される殺藻物質を同定するためのメタボロミクス解析方法を確立した。解析の結果、共培養下で特異的に産生される化合物を見出し、赤潮原因藻類に対する殺藻物質として報告のあるpseudopyronine Aであり、またアオコ原因藻類である藍藻Microcystis aeruginosaに対しても顕著な活性を示した。以上の結果から、確立したメタボロミクス法は共培養で機能する殺藻物質を見出す手法として有望と考えられた。
    ② 赤潮・アオコ発生促進に関与する微生物の存在解析 Pseudomonas属殺藻細菌の機能解析の過程において緑藻および浮草などの光合成生物に対して増殖促進活性を示す植物ホルモン様化合物を見いだした。また、Pseudomonas属殺藻細菌の産物であるpyoluteorinを環境試水に作用したところ、緑藻Chlamydomonasが顕著に増加した。
    ③ 未分離未培養の殺藻細菌の検出とそれが生産する殺藻物質の同定 メタゲノム解析から水草バイオフィルムがPseudomonas属、Acidovorax属、Stenotrophomonas属、Rhizobium属などの培養可能な殺藻細菌の供給源である事が示された。また、殺藻細菌の割合はいずれも1－3％程度の存在率で十分な活性を示す事、未培養の殺藻細菌候補も存在する事が示唆された。
    ④ 分離殺藻細菌からの殺藻物質および生合成遺伝子の同定 環境試料から新たにRhizobium属、Stenotrophomonas属、Hydrogenophaga属を主とする殺藻細菌を得て、その培養液に殺藻活性を検出している。そのうちの一つであるRhizobium属細菌の培養液から、殺藻活性を示す炭化水素の結晶を得た。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 20H03070
  • Cultivation of the uncultured symbiotic bacteria based on the metagenomic information
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    29 Jun. 2018 - 31 Mar. 2021
    Fujita Masaki
    In order to develop a methodology for isolation and cultivation of the useful marine natural products producing bacteria, we conducted metagenomic and symbiotic condition analysis of the mycalolide producing bacterium using marine sponge genus Mycale as a model organisms. As a result, complete cyclic genome of mycalolide producer was determined. Although the genome size was shrunk compared to that of the related culturable species, the basic metabolic capacity was conserved. It was also confirmed that the producing bacterium is extracellular symbiont existing from the embryonic stage by vertical transmission from the previous generation. In addition, it was also observed that the bacterium was transferred from the parental generation through a bacteriocyte-like structure. These findings are expected to lead to development of isolation and cultivation techniques of valuable bacteria based on the metabolic control and symbiosis mechanisms.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory), Hokkaido University, 18K19221
  • Identification of functional compounds and biosynthetic genes by metagenomic methods
    Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
    01 Apr. 2015 - 31 Mar. 2019
    Fujita Masaki; Imai Ichiro; Kimura Nobutada
    In order to clarify the chemical communication among the environmental microorganisms, general scheme consisted of following methods and knowledges; metagenomics, biosynthesis, isolation and structure elucidation, bioinformatics, and variety of bioassays, were established.
    Species, compounds, and biosynthetic genes clusters were identified from algicidal bacteria obtained from algal-blooming environmental samples. Furthermore, mechanisms of production and action of the active compounds were revealed which are important for practical usage of algicidal bacteria.
    From the metagenomic clones, novel super-agonist of quorum sensing whose structure was completely different from the known signaling molecule was determined. Biosynthetic gene cluster of anti-tumor substance and its producer were identified from marine sponge symbiotic bacteria by metagenomics analysis. The producer is a quite unique bacterium belongs to the putative novel phylum, and exist in the specific marine sponge.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Young Scientists (A), Hokkaido University, 15H05629
  • レポーターアッセイを用いた海洋メタゲノムからの新規生合成マシナリーの探索
    科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2015
    藤田 雅紀
    グラム陰性細菌のクオラムセンシングに関与するLux系を改変したレポーターアッセイシステムを用いて、メタゲノム法による未培養微生物のクオラムセンシングに関して解析を行った。陸上由来のメタゲノムライブラリから、レポーターアッセイの結果を指標に取得した活性物質生産クローンは、予想されたアシルホモセリンラクトンの生合成遺伝子ではなく、モノオキシゲナーゼに相同性を示す遺伝子を保有していた。
    また、活性クローンは青色色素であるインジゴを生産したが、インジゴにはクオラムセンシグ活性は無かった事から、他の微量生産物が活性本体であると考えられた。活性クローンを大量培養後、培養上清および菌体を有機溶媒で抽出し、レポーターアッセイ結果を指標に抽出物の分画を行った。逆相および順相クロマトグラフィー、複数の担体によるゲルろ過、4種のカラムを用いたHPLC分画により、40 Lの培養液から0.1 mg以下の活性物質を単一ピークとして取得した。
    ESI-LC-MSによる分析から本物質は分子量293であり、また高分解質量分析結果からその分子式をC16H11N3O3と推測した。これは関連が推測されたインジゴと比較しNOH大きいものであった。また、重水素交換実験から、交換性プロトンを3個含むと推測された。
    また、海洋メタゲノムライブラリ中に複数見出されたインジゴ生産クローンについても解析したところ、いずれもクオラムセンシング活性物質を生産していた。一方、それらクローンが保有する酸化酵素は陸上メタゲノム由来のものと比較して相同性が10％程度であり、配列的にはほぼ関連が無かった。以上のことから、未知のクオラムセンシング物質の生産には酵素の配列では無く、インジゴの産生能が大きく関与していることが推測された。また、陸上海洋問わず、広く分布する酵素により産生されることが示唆された。
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 25108701
  • メタゲノム法による難培養海洋環境微生物からの新規生合成マシナリーの探索と物質生産
    科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
    01 Apr. 2011 - 31 Mar. 2013
    藤田 雅紀
    海洋メタゲノムからの新規生合成マシナリーの探索を目的に研究を行った。その結果、研究期間において多様な海洋サンプルから70万以上のメタゲノムクローンを構築した。また複数のスクリーニング系において合計200を超える活性クローンを見出し、そのうち13クローンについてはDNA配列の決定も行った。その中には既知遺伝子に相同性を示すものも存在した一方、配列相同性からは全く活性機構が不明なものも存在し、未知のマシナリーを取得できた可能性が期待された。
    シデロフォア生産クローンのうち二つについてはその生産物を同定し、また生合成遺伝子クラスターに変異を加えることで、最終産物の構造変換を行うなどの応用研究も展開し、生物生産の多様化の例を示した。さらにメタゲノムから取得したbisucaberin 生合成酵素は未解明な点が多い、酵素による大環状化反応機構の解明に有用であると考え構造生物学的な検討を行っている。また、別のシデロフォア生産クローンの一つを解析したところ、生合成遺伝子クラスター全長が25 kbp程度と非常に大きく、これまでにメタゲノムから機能ベーススクリーニング法で取得した生合成遺伝子クラスターとしては最大級のものであった。未だ生産物の同定には至っていないが、配列上の特徴から新規化合物を生産していると考えられた。この結果はメタゲノム法で非常に大きな生合成遺伝子クラスターを取得可能であること、またそれを異宿主で発現し活性物質を生産できることを示すものであり、本方法論の実用性を示す例であると考える。
    一方、抗菌活性クローンの一つが保有するDNA配列を決定したが、配列情報からは全く活性機構を予測することはできなかった。現在生産物の同定を進めているが、このように配列情報からは見出すことが困難な遺伝子を取得できたことは機能ベースメタゲノム法の有用な点であると考える。
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 23108517
  • Cloning and Expression of Siderophore Biosynthetic Gene Clusters from Marine Metagenome
    Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
    2011 - 2012
    FUJITA Masaki
    More than 50 siderophore producing clones were found from the marine metagenomic library. Among them, DNA sequences of the four clones were determined. By chemical and spectroscopic methods, vibrioferrin and bisucaberin were identified as active products from the obtained clones. Especially, isolation yield of vibrioferrin was 40 times higher than that of the original producer. The other clone had a biosynthetic gene cluster whose total size was about 25 kbp which is one of the largest one found by functional metagenomic screening. These results suggested the promising potential of the functional metagenomic technique for cloning of biosynthetic genes and heterologous production of active molecules.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Young Scientists (B), Hokkaido University, 23790134
  • Research for useful marineorganisms in Asia and Pacific regions
    Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    2009 - 2011
    NAKAO Yoichi; HORI Kanji; SAKAI Ryuichi; FUSETANI Nobuhiro; MATSUOKA Shunji; FUKUZAWA Seketsu; WAKIMOTO Toshiyuki; FUJITA Masaki; TAKADA Kentarou
    In this project, a total 515 marine organisms were collected from 3 countries and preserved as the extract-, microbe-, and genome-libraries. Currently, evaluation for bioactivities of these extracts are being carried out. At the same time, thight collaborative relationship among the researchers of these countries and our group was founded, through this project.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Waseda University, 21404010
  • Cloning and Expression of Marine Natural Product Biosynthetic by Function Based Screening
    Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
    2008 - 2009
    FUJITA Masaki
    Metagenomics is a promising method to obtain useful genes from environmental samples. In order to prove that metagenomics is applicable to produce marine natural products, high quality marine metagenomic library consist of about 100 thousands clones was constructed. More than 300 pigment producing clones were screened from the library and their biosynthetic genes and products were characterized.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up), Kumamoto University, 20810022
  • 抗転移剤の開発を指向した海洋無脊椎動物からのプロテアーゼ阻害物質の探索
    科学研究費助成事業 特別研究員奨励費
    2001 - 2002
    藤田 雅紀
    1.日本沿岸各地で採集された海洋無脊椎動物の抽出物、計2608検体について、ガン転移に深く関与していると考えられるカテプシンB、MT1-MMPおよびMMP2に対する阻害アッセイを行った。その結果それぞれの酵素に対して約8%のサンプルが阻害活性を示した。その中から、特に活性が強く、酵素間の選択性に優れたサンプルについてその活性本体の解明を試みた。
    2.MT1-MMP阻害活性が認められた、高知県二並島産海綿Chribrochalina sp.の抽出物を、各種クロマトグラフィーで順次精製したところ、2つの阻害物質を単離した。阻害物質のスペクトルデータは、既知物質haplosamate Aと完全に一致したが、報告されたデータにいくつかの疑問点を認めたので、詳細な構造解析を行った。その結果、本物質の構造をリン酸化ステロールと改定した。なお、本物質はMT1-MMPをIC_<50>値150-180μg/mLで阻害した。
    3.和歌山県五ヶ所湾産のPolyclinidae科ホヤの脂溶性抽出物に顕著なMMP2阻害活性が認められた。凍結資料を抽出後、各種クロマトグラフィーにより精製し、活性成分として1-(12-hydroxy)octadecanyl sulfateを単離した。その構造は各種スペクトルデータから、C_<18>の硫酸化アルコールと決定した。本物質はMMP2をIC_<50>値9.0μg/mLで阻害した。
    4.高知県箱島産海綿、Callyspongia truncataからは、MT1-MMP阻害物質として、既知物質であるhalistanol sulfateとともに、新規化合物であるcallysponginol sulfate Aを得た。本物質の構造は、分光学および化学的な解析からC_<24>の硫酸化された不飽和脂肪酸であることが明らかになった。本阻害剤はMI1-分光学MMPをIC_<50>値15.0μg/mLで阻害した。
    日本学術振興会, 特別研究員奨励費, 東京大学, 01J05978