研究者データベース

堀内 基広(ホリウチ モトヒロ)
獣医学研究院 獣医学部門 衛生学分野
教授

基本情報

所属

  • 獣医学研究院 獣医学部門 衛生学分野

職名

  • 教授

学位

  • 獣医学博士(北海道大学)

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J-Global ID

研究キーワード

  • カンピロバクター   網羅的遺伝子発現解析   プリオン   スクレイピー   BSE   伝達性海綿状脳症   PrP   アストロサイト   神経変性   構造転換   合成ペプチド   PrPSc   猫パルボウイルス亜群   モンゴル   再生医療   バイエル氏板   走化性   消化管付髄リンパ装置   濾胞樹状細胞   モノクロナール抗体   神経細胞死   骨髄由来間葉系幹細胞   分子進化   MEV   遺伝子型   ALYマウス   ミクログリア   siRNA   PCR   FPLV   Neuro2a   

研究分野

  • ライフサイエンス / 獣医学
  • ライフサイエンス / 獣医学
  • ライフサイエンス / 獣医学
  • ライフサイエンス / 獣医学
  • ライフサイエンス / 獣医学
  • ライフサイエンス / 獣医学
  • ナノテク・材料 / 生物分子化学
  • ライフサイエンス / ウイルス学
  • ナノテク・材料 / 高分子化学

職歴

  • 2003年08月 - 現在 北海道大学 (連合)獣医学研究科 教授
  • 2000年04月 - 2003年07月 帯広畜産大学原虫病研究センター 助教授
  • 1996年06月 - 2000年03月 帯広畜産大学原虫病分子免疫研究センター 助教授
  • 1997年07月 - 1999年07月 米国国立衛生研究所 訪問研究員
  • 1989年01月 - 1996年05月 帯広畜産大学畜産学部 助手
  • 1988年04月 - 1988年12月 日本ロシュ(株)

研究活動情報

論文

  • Rie Hasebe, Akio Suzuki, Takeshi Yamasaki, Motohiro Horiuchi
    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 454 1 125 - 130 2014年11月 [査読有り][通常論文]
     
    CD14 deficient (CD14(-/-)) mice survived longer than wild-type (WT) C57BL/6J mice when inoculated with prions intracerebrally, accompanied by increased expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 by microglia in the early stage of infection. To assess the immune regulatory effects of CD14 in detail, we compared the gene expression of pro- and anti-inflammatory cytokines in the brains of WT and CD14(-/-) mice infected with the Chandler strain. Gene expression of the anti-inflammatory cytokine IL-13 in prion-infected CD14(-/-) mice was temporarily upregulated at 75 dpi, whereas IL-13 gene expression was not upregulated in prion-infected WT mice. Immunofluorescence staining showed that IL-13 was mainly expressed in neurons of the thalamus at 75 dpi. These results suggest that CD14 can suppress IL-13 expression in neurons during the early stage of prion infection. (C) 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Takeshi Yamasaki, Akio Suzuki, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    PLOS ONE 9 9 e106516  2014年09月 [査読有り][通常論文]
     
    Molecules that inhibit the formation of an abnormal isoform of prion protein (PrPSc) in prion-infected cells are candidate therapeutic agents for prion diseases. Understanding how these molecules inhibit PrPSc formation provides logical basis for proper evaluation of their therapeutic potential. In this study, we extensively analyzed the effects of the anti-PrP monoclonal antibody (mAb) 44B1, pentosan polysulfate (PPS), chlorpromazine (CPZ) and U18666A on the intracellular dynamics of a cellular isoform of prion protein (PrPC) and PrPSc in prion-infected mouse neuroblastoma cells to re-evaluate the effects of those agents. MAb 44B1 and PPS rapidly reduced PrPSc levels without altering intracellular distribution of PrPSc. PPS did not change the distribution and levels of PrPC, whereas mAb 44B1 appeared to inhibit the trafficking of cell surface PrPC to organelles in the endocytic-recycling pathway that are thought to be one of the sites for PrPSc formation. In contrast, CPZ and U18666A initiated the redistribution of PrPSc from organelles in the endocytic-recycling pathway to late endosomes/lysosomes without apparent changes in the distribution of PrPC. The inhibition of lysosomal function by monensin or bafilomycin A1 after the occurrence of PrPSc redistribution by CPZ or U18666A partly antagonized PrPSc degradation, suggesting that the transfer of PrPSc to late endosomes/lysosomes, possibly via alteration of the membrane trafficking machinery of cells, leads to PrPSc degradation. This study revealed that precise analysis of the intracellular dynamics of PrPC and PrPSc provides important information for understanding the mechanism of anti-prion agents.
  • Leo Uchida, Agus Heriyanto, Chalermchaikit Thongchai, Tran Thi Hanh, Motohiro Horiuchi, Kanako Ishihara, Yutaka Tamura, Yasukazu Muramatsu
    JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE 76 7 1001 - 1008 2014年07月 [査読有り][通常論文]
     
    There has been an accumulation of information on frequencies of insertion/deletion (indel) polymorphisms within the bovine prion protein gene (PRNP) and on the number of octapeptide repeats and single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the coding region of bovine PRNP related to bovine spongi form encephalopathy (BSE) susceptibility. We investigated the frequencies of 23-bp indel polymorphism in the promoter region (23indel) and 12-bp indel polymorphism in intron 1 region (12indel), octapeptide repeat polymorphisms and SNPs in the bovine PRNP of cattle and water buffaloes in Vietnam, Indonesia and Thailand. The frequency of the deletion allele in the 23indel site was significantly low in cattle of Indonesia and Thailand and water buffaloes. The deletion allele frequency in the 12indel site was significantly low in all of the cattle and buffaloes categorized in each subgroup. In both indel sites, the deletion allele has been reported to be associated with susceptibility to classical BSE. In some Indonesian local cattle breeds, the frequency of the allele with 5 octapeptide repeats was significantly high despite the fact that the allele with 6 octapeptide repeats has been reported to be most frequent in many breeds of cattle. Four SNPs observed in Indonesian local cattle have not been reported for domestic cattle. This study provided information on PRNP or livestock in these Southeast Asian countries.
  • Takeshi Yamasaki, Gerald S. Baron, Akio Suzuki, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    VIROLOGY 450 324 - 335 2014年02月 [査読有り][通常論文]
     
    To clarify the cellular mechanisms for the establishment of prion infection, we analyzed the intracellular dynamics of inoculated and newly generated abnormal isoform of prion protein (PrPSc) in Neuro2a cells. Within 24 h after inoculation, the newly generated PrPSc was evident at the plasma membrane, in early endosomes, and in late endosomes, but this PrPSc was barely evident in lysosomes; in contrast, the majority of the inoculated PrPSc was evident in late endosomes and lysosomes. However, during the subsequent 48 h, the newly generated PrPSc increased remarkably in early endosomes and recycling endosomes. Overexpression of wild-type and mutant Rab proteins showed that membrane trafficking along not only the endocytic-recycling pathway but also the endo-lysosomal pathway is involved in de novo PrPSc generation. These results suggest that the trafficking of exogenously introduced PrPSc from the endo-lysosomal pathway to the endocytic-recycling pathway is important for the establishment of prion infection. (C) 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Keiko Sakai, Rie Hasebe, Yusuke Takahashi, Chang-Hyun Song, Akio Suzuki, Takeshi Yamasaki, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF VIROLOGY 87 24 13433 - 13445 2013年12月 [査読有り][通常論文]
     
    Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders characterized by accumulation of PrPSc, vacuolation of neurons and neuropil, astrocytosis, and microglial activation. Upregulation of gene expressions of innate immunity-related factors, including complement factors and CD14, is observed in the brains of mice infected with prions even in the early stage of infections. When CD14 knockout (CD14(-/-)) mice were infected intracerebrally with the Chandler and Obihiro prion strains, the mice survived longer than wild-type (WT) mice, suggesting that CD14 influences the progression of the prion disease. Immunofluorescence staining that can distinguish normal prion protein from the disease-specific form of prion protein (PrPSc) revealed that deposition of PrPSc was delayed in CD14(-/-) mice compared with WT mice by the middle stage of the infection. Immunohistochemical staining with Iba1, a marker for activated microglia, showed an increased microglial activation in prion-infected CD14(-/-) mice compared to WT mice. Interestingly, accompanied by the increased microglial activation, anti-inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor beta (TGF-beta) appeared to be expressed earlier in prion-infected CD14(-/-) mice. In contrast, IL-1 beta expression appeared to be reduced in the CD14(-/-) mice in the early stage of infection. Double immunofluorescence staining demonstrated that CD11b- and Iba1-positive microglia mainly produced the anti-inflammatory cytokines, suggesting anti-inflammatory status of microglia in the CD14(-/-) mice in the early stage of infection. These results imply that CD14 plays a role in the disease progression by suppressing anti-inflammatory responses in the brain in the early stage of infection.
  • Natsuo Ohsawa, Chang-Hyun Song, Akio Suzuki, Hidefumi Furuoka, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 57 4 288 - 297 2013年04月 [査読有り][通常論文]
     
    It is generally thought that effective treatments for prion diseases need to inhibit prion propagation, protect neuronal tissues and promote functional recovery of degenerated nerve tissues. In addition, such treatments should be effective even when given after clinical onset of the disease and administered via a peripheral route. In this study, the effect of peripheral administration of an anti-PrP antibody on disease progression in prion-infected mice was examined. mAb 31C6 was administered via the tail veins of prion-infected mice at the time of clinical onset (120 days post-inoculation with the Chandler prion strain) and the distribution of this mAb in the brain and its effect on mouse survival assessed. The antibody was distributed to the cerebellums and thalami of the infected mice and more than half these mice survived longer than mice that had been given a negative control mAb. The level of PrPSc in the mAb 31C6-treated mice was lower than that in mice treated with the negative control mAb and progression of neuropathological lesions in the cerebellum, where the mAb 31C6 was well distributed, appeared to be mitigated. These results suggest that administration of an anti-PrP mAb through a peripheral route is a candidate for the treatment of prion diseases.
  • Yasuhiro Yoshikawa, Motohiro Horiuchi, Naotaka Ishiguro, Mutsuyo Kadohira, Satoshi Kai, Hidehiro Mizusawa, Chisato Nagata, Takashi Onodera, Tetsutaro Sata, Toshiyuki Tsutsui, Masahito Yamada, Shigeki Yamamoto
    JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE 74 8 959 - 968 2012年08月 [査読有り][通常論文]
     
    The Food Safety Commission (FSC) of Japan, established in July 2003, has its own initiative to conduct risk assessments on food stuffs known as "self-tasking assessment". Within this framework, the FSC decided to conduct a risk assessment of beef and beef offal imported into Japan from countries with no previous BSE reports; thus, a methodology was formed to suit to this purpose. This methodology was partly based on the previous assessments of Japanese domestic beef and beef imported from U.S.A./Canada, but some modifications were made. Other organizations' assessment methods, such as those used for BSE status assessment in live cattle by the OIE and EFSA's GBR, were also consulted. In this review, the authors introduce this alternative methodology, which reflects (1) the risk of live cattle in the assessed country including temporal risks of BSE invasion and domestic propagation, with the assessment results verified by surveillance data, and (2) the risk of beef and beef offal consisting of cumulative BSE risk by types of slaughtering and meat production processes implemented and the status of mechanically recovered meat production. Other possible influencing factors such as atypical BSE cases were also reviewed. The key characteristic of the current assessment is a combination of the time-sequential risk level of live cattle and qualitative risk level of meat production at present in an assessed country.
  • Gaku Nakato, Koji Hase, Michio Suzuki, Masanobu Kimura, Manabu Ato, Misaho Hanazato, Minoru Tobiume, Motohiro Horiuchi, Ryuichiro Atarashi, Noriyuki Nishida, Masahisa Watarai, Koichi Imaoka, Hiroshi Ohno
    JOURNAL OF IMMUNOLOGY 189 4 1540 - 1544 2012年08月 [査読有り][通常論文]
     
    Brucella abortus is a Gram-negative bacterium causing brucellosis. Although B. abortus is known to infect via the oral route, the entry site in the gastrointestinal tract has been unclear. We found that B. abortus was selectively internalized by microfold cells (M cells), a subset of epithelial cells specialized for mucosal Ag uptake. During this process, colocalization of cellular prion protein (PrPC) and B. abortus was evident on the apical surface as well as in subapical vacuolar structures in M cells. Internalization of B. abortus by M cells of PrPC-deficient (Prnp(-/-)) mice was greatly reduced compared with that in wild-type mice. Furthermore, an oral infection study revealed that translocation of B. abortus into the Peyer's patch was significantly lower in Prnp(-/-) than in wild-type mice. These observations suggest that orally infected B. abortus invades the host through M cells by using PrPC on the apical surface of M cells as an uptake receptor. The Journal of Immunology, 2012, 189: 1540-1544.
  • Takeshi Yamasaki, Akio Suzuki, Takeshi Shimizu, Masahisa Watarai, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY 93 3 668 - 680 2012年03月 [査読有り][通常論文]
     
    Generation of an abnormal isoform of the priori protein (PrPSc) is a key aspect of the propagation of prions. Elucidation of the intracellular localization of PrPSc in prion-infected cells facilitates the understanding of the cellular mechanism of prion propagation. However, technical improvement in PrPSc-specific detection is required for precise analysis. Here, we show that the mAb 132, which recognizes the region adjacent to the most amyloidogenic region of PrP, is useful for PrPSc-specific detection by immunofluorescence assay in cells pre-treated with guanidine thiocyanate. Extensive analysis of the intracellular localization of PrPSc in priori-infected cells using mAb 132 revealed the presence of PrPSc throughout endocytic compartments. In particular, some of the granular PrPSc signals that were clustered at pen-nuclear regions appeared to be localized in an endocytic recycling compartment through which exogenously loaded transferrin, shiga and cholera toxin B subunits were transported. The granular PrPSc signals at pen-nuclear regions were dispersed to the peripheral regions including the plasma membrane during incubation at 20 degrees C, at which temperature transport from the plasma membrane to pen-nuclear regions was impaired. Conversely, dispersed PrPSc signals appeared to return to pen-nuclear regions within 30 min during subsequent incubation at 37 degrees C, following which PrPSc at pen-nuclear regions appeared to redisperse again to peripheral regions over the next 30 min incubation. These results suggest that PrPSc is dynamically transported along with the membrane trafficking machinery of cells and that at least some PrPSc circulates between pen-nuclear and peripheral regions including the plasma membrane via an endocytic recycling pathway.
  • Rie Hasebe, Gregory J. Raymond, Motohiro Horiuchi, Byron Caughey
    VIROLOGY 423 2 205 - 213 2012年02月 [査読有り][通常論文]
     
    Roles of complement factors in prion infection of the central nervous system remain unclear. In this study, we assessed the strain-dependent reactivity of complement factors in prion infections of Neuro2a (N2a) cells and mouse brains. N2a cells persistently infected with either Chandler or 22L scrapie strains were cultured in the presence of normal mouse serum (NMS), followed by staining with phosphatidylserine binding protein and early apoptosis marker Annexin V. The proportion of Annexin V positive cells was increased both in Chandler- and 22L-infected cells. Preincubation of NMS with anti-C1q, C3 and/or C9 antibodies reduced Annexin V positive cells in Chandler-infected cells, while only anti-C3 antibodies were effective on 22L-infected cells. The immunohistochemistry showed that deposition of C1q and C3 was different between Chandler- and 22L-infected mouse brains. These results indicate that the reactivity of complement factors differs between prion strains both in vitro and in vivo. (C) 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Chang-Hyun Song, Osamu Honmou, Hidefumi Furuoka, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF VIROLOGY 85 21 11069 - 11078 2011年11月 [査読有り][通常論文]
     
    Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported to migrate to brain lesions of neurodegenerative diseases; however, the precise mechanisms by which MSCs migrate remain to be elucidated. In this study, we carried out an in vitro migration assay to investigate the chemoattractive factors for MSCs in the brains of prion-infected mice. The migration of immortalized human MSCs (hMSCs) was reduced by their pretreatment with antibodies against the chemokine receptors, CCR3, CCR5, CXCR3, and CXCR4 and by pretreatment of brain extracts of prion-infected mice with antibodies against the corresponding ligands, suggesting the involvement of these receptors, and their ligands in the migration of hMSCs. In agreement with the results of an in vitro migration assay, hMSCs in the corpus callosum, which are considered to be migrating from the transplanted area toward brain lesions of prion-infected mice, expressed CCR3, CCR5, CXCR3, and CXCR4. The combined in vitro and in vivo analyses suggest that CCR3, CCR5, CXCR3, and CXCR4, and their corresponding ligands are involved in the migration of hMSCs to the brain lesions caused by prion propagation. In addition, hMSCs that had migrated to the right hippocampus of prion-infected mice expressed CCR1, CX3CR1, and CXCR4, implying the involvement of these chemokine receptors in hMSC functions after chemotactic migration. Further elucidation of the mechanisms that underlie the migration of MSCs may provide useful information regarding application of MSCs to the treatment of prion diseases.
  • Sassa Y, Yamamoto H, Mochizuki M, Umemura T, Horiuchi M, Ishiguro N, Miyazawa T
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 73 4 491 - 494 4 2011年04月 [査読有り][通常論文]
  • Yukiko Sassa, Takeshi Yamasaki, Motohiro Horiuchi, Yasuo Inoshima, Naotaka Ishiguro
    MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 54 12 763 - 768 2010年12月 [査読有り][通常論文]
     
    It has been reported that macrophages degrade infectious forms of prion protein (PrPSc). In order to investigate the mechanisms underlying PrPSc degradation in macrophages, the effects of lysosomal and proteasomal inhibitors on macrophage cell lines which were incubated with scrapie-affected brain homogenate were studied. PrPSc degradation was inhibited in the presence of both proteasomal and lysosomal inhibitors. Indirect fluorescence assays to determine the cellular localization of PrPSc were undertaken. PrPSc colocalized with the lysosomal membrane protein Lamp-1 and ubiquitin, a protein that is related to the proteasome. The present data indicate that macrophages might degrade PrPSc via the lysosomal and proteasomal pathways.
  • Rie Hasebe, Tadaki Suzuki, Yoshinori Makino, Manabu Igarashi, Satoko Yamanouchi, Akihiko Maeda, Motohiro Horiuchi, Hirofumi Sawa, Takashi Kimura
    BMC MICROBIOLOGY 10 165  2010年06月 [査読有り][通常論文]
     
    Background: West Nile virus (WNV) causes viremia after invasion to the hosts by mosquito bite. Endothelial cells could play an important role in WNV spread from the blood stream into the central nervous system and peripheral tissues. Here, we analyzed the capacity of virus-like particles (VLPs) of the highly virulent NY99 6-LP strain (6-LP VLPs) and the low virulence Eg101 strain (Eg VLPs) to cross cultured human endothelial cells. Results: 6-LP VLPs were transported from the apical to basolateral side of endothelial cells, whereas Eg VLPs were hardly transported. The localization of tight junction marker ZO-1 and the integrity of tight junctions were not impaired during the transport of 6-LP VLPs. The transport of 6-LP VLPs was inhibited by treatment with filipin, which prevents the formation of cholesterol-dependent membrane rafts, suggesting the involvement of raft-associated membrane transport. To determine the amino acid residues responsible for the transport of VLPs, we produced mutant VLPs, in which residues of E protein were exchanged between the 6-LP and Eg strains. Double amino acid substitution of the residues 156 and 159 greatly impaired the transport of VLPs. Conclusion: Our results suggest that a transcellular pathway is associated with 6-LP VLPs transport. We also showed that the combination of the residues 156 and 159 plays an important role in the transport of VLPs across endothelial cells.
  • Yuko Sato, Nozomi Shimonohara, Ken-Ichi Hanaki, Motoki Goto, Yoshio Yamakawa, Motohiro Horiuchi, Hidehiro Takahashi, Tetsutaro Sata, Noriko Nakajima
    JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS 165 2 261 - 267 2010年05月 [査読有り][通常論文]
     
    The AT-tailing method is a labelling technique that utilises oligo(dA-dT)-dependent signal amplification. In this study, a new immunohistochemical application of the immunoAT method was developed. This method uses an oligo(dA-dT)-conjugated primary antibody (direct immunoAT method) or an oligo(dA-dT)-conjugated secondary antibody (indirect immunoAT method). Fifteen-base oligo(dA-dT)conjugated antibodies (IgG-ATs) were prepared in advance by conjugating maleimide-activated oligo(dA-dT) to IgG via free sulfhydryl residues that had been introduced on the surface of IgG using Traut's reagent. Following the reaction with the target antigen and the IgG-AT, oligo(dA-dT) was elongated by Delta Tth DNA polymerase in the presence of dATP, dTTP and biotinylated dUTP, consequently labelling the antigen-antibody complex with a large amount of biotin. To initially evaluate the immunoAT method, the presence or absence of prion protein (PrP(sc)) was determined in formalin-fixed and paraffin-embedded sections of the medulla oblongata of cattle which had been under active surveillance for bovine spongiform encephalopathy. Sections were examined using direct and indirect immunoAT methods and the EnVision+ system (Dako) under conditions that were identical except for the differing IgG-AT and AT-tailing methods. PrP(sc) detection was consistent using all three methods. The clearest signals were obtained using the indirect immunoAT method, suggesting significant potential for this method. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.
  • Yasuko Watanabe, Wakako Hiraoka, Manabu Igarashi, Kimihito Ito, Yuhei Shimoyama, Motohiro Horiuchi, Tohru Yamamoria, Hironobu Yasui, Mikinori Kuwabara, Fuyuhiko Inagaki, Osamu Inanami
    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 394 3 522 - 528 2010年04月 [査読有り][通常論文]
     
    To explore Cu(II) ion coordination by His(186) in the C-terminal domain of full-length prion protein (moPrP), we utilized the magnetic dipolar interaction between a paramagnetic metal, Cu(II) ion, and a spin probe introduced in the neighborhood of the postulated binding site by the spin labeling technique (SDSL technique) Six moPrP mutants. moPrP(D143C), moPrP(Y148C), moPrP(E151C), moPrP(Y156C), moPrP(T189C). and moPrP(Y156C,H186A), were reacted with a methane thiosulfonate spin probe and a nitroxide residue (R1) was created in the binding site of each one Line broadening of the ESR spectra was induced in the presence of Cu(II) ions in moPrP(Y148R1), moPrP(Y151R1). moPrP(Y156R1), and moPrP(T189R1) but not moPrP(D143R1) This line broadening indicated the presence of electron-electron dipolar interaction between Cu(II) and the rutroxide spin probe, suggesting that each interspin distance was within 20 angstrom The interspin distance ranges between Cu(II) and the spin probes of moPrP(Y148R1), inoPrP(Y151R1), moPrP(Y156R1), and moPrP(T189R1) were estimated to be 12 1 angstrom, 18 1 angstrom, 107 angstrom, and 84 angstrom, respectively In moPrP(Y156R1,H186A), line broadening between Cu(II) and the spin probe was not observed These results suggest that a novel Cu(II) binding site is involved in His186 in the Helix2 region of the C-terminal domain of moPrP(C) (C) 2010 Elsevier Inc All rights reserved
  • Satoshi Nakamitsu, Aya Kurokawa, Takeshi Yamasaki, Masahide Uryu, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY 91 2 563 - 569 2010年02月 [査読有り][通常論文]
     
    Cells persistently infected with prions continuously produce protease-resistant prion protein (PrP-res). Here, we show that the FrP-res level in prion-infected Neuro2a (N2a) neuroblastoma cells decreased to 50 % of their initial level over the first 48 h and then recovered by 96 h after seeding. The level of cellular prion protein (PrP(C)) also appeared to fluctuate, but did not influence the fluctuation of the PrP-res level. Prion-infected N2a cells, co-cultured with a higher number of prion-unsusceptible cells, had twice as much PrP-res as those cultured without unsusceptible cells, suggesting that cell density influences the fluctuation of PrP-res as. Direct cell-to-cell contact between cells, rather than soluble factors, was involved in the cell density-dependent increase in the PrP-res level. The cholesterol content, which is known to influence PrP-res formation, also changed depending on cell density. Our data suggest that alterations in cellular microenvironments controlled by cell density influence PrP-res formation.
  • Hiroshi Sakata, Motohiro Horiuchi, Izumi Takahashi, Masataka Kinjo
    CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY 11 1 87 - 95 2010年01月 [査読有り][通常論文]
     
    The conversion of prion protein (PrP) from the monomeric cellular isoform to the oligomeric pathological isoform is a crucial event in the pathogenesis of prion diseases. To investigate oligomer formation of PrP, enhanced green fluorescent protein (EGFP)-tagged PrP (EGFP-PrP) without the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor was prepared and the oligomerization of EGFP-PrP induced by sodium dodecyl sulphate (SDS) was monitored by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The FCS analysis indicated that soluble oligomers were formed at 0.011% SDS. Furthermore, the combination of fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) and a panel of anti-PrP monoclonal antibodies (mAbs) revealed the conformational changes in PrP. Our studies provide a method to analyze conformational changes of proteins in solution.
  • Motohiro Horiuchi, Ayako Karino, Hidefumi Furuoka, Naotaka Ishiguro, Kumiko Kimura, Morikazu Shinagawa
    VIROLOGY 394 2 200 - 207 2009年11月 [査読有り][通常論文]
     
    To establish PrPSc-specific mAbs, we immunized Pmp(-/-) mice with PrPSc purified from prion-infected mice. Using this approach, we obtained mAb 6H10, which reacted with PrPSc treated with proteinase K, but not with PrPSc pretreated with more than 3 M GdnHCl. In contrast, reactivity of pan-PrP mAbs increased with increasing concentrations of GdnHCl used for pretreatment of PrPSc. In histoblot analysis, mAb 6H10 showed a positive reaction on a non-denatured histoblot but reactivity was lower when the histoblot was pretreated by autoclaving. Epitope analysis suggested that the extreme C-terminus of PrP is likely to be part of the epitope for mAb 6H10. MAb 6H10 immunoprecipitated PrPSc from brains of mice, sheep, and cattle infected with prions. Furthermore, pretreatment of purified PrPSc with mAb 6H10 reduced the infectious titer more than 1 log. Taken together, these results suggest that mAb 6H10 recognizes a conformational epitope on PrPSc that is related to prion infectivity. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Chang-Hyun Song, Osamu Honmou, Natsuo Ohsawa, Kiminori Nakamura, Hirofumi Hamada, Hidefumi Furuoka, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF VIROLOGY 83 11 5918 - 5927 2009年06月 [査読有り][通常論文]
     
    Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported to migrate to brain lesions in experimental models of ischemia, tumors, and neurodegenerative diseases and to ameliorate functional deficits. In this study, we attempted to evaluate the therapeutic potential of MSCs for treating prion diseases. Immortalized human MSCs (hMSCs) that express the LacZ gene were transplanted into the unilateral hippocampi or thalami of mice, and their distributions were monitored by the expression of beta-galactosidase. In mice infected with prions, hMSCs transplanted at 120 days postinoculation (dpi) were detected on the contralateral side at 2 days after transplantation and existed there even at 3 weeks after transplantation. In contrast, few hMSCs were detected on the contralateral side for mock-infected mice. Interestingly, the migration of hMSCs appeared to correlate with the severity of neuropathological lesions, including disease-specific prion protein deposition. The hMSCs also migrated to a prion-specific lesion in the brain, even when intravenously injected. Although the effects were modest, intrahippocampal and intravenous transplantation of hMSCs prolonged the survival of mice infected with prions. A subpopulation of hMSCs in the brains of prion-infected mice produced various trophic factors and differentiated into cells of neuronal and glial lineages. These results suggest that MSCs have promise as a cellular vehicle for the delivery of therapeutic genes to brain lesions associated with prion diseases and, furthermore, that they may help to regenerate neuronal tissues damaged by prion propagation.
  • Ryo Shindoh, Chan-Lan Kim, Chang-Hyun Song, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF VIROLOGY 83 8 3852 - 3860 2009年04月 [査読有り][通常論文]
     
    Although the major component of the prion is believed to be the oligomer of PrPSc, little information is available concerning regions on the PrPSc molecule that affect prion infectivity. During the analysis of PrPSc molecules from various prion strains, we found that PrPSc of the Chandler strain showed a unique property in the conformational-stability assay, and this property appeared to be useful for studying the relationship between regions of the PrPSc molecule and prion infectivity. Thus, we analyzed PrPSc of the Chandler strain in detail and analyzed the infectivities of the N-terminally denatured and truncated forms of proteinase K-resistant PrP. The N-terminal region of PrPSc of the Chandler strain showed region-dependent resistance to guanidine hydrochloride (GdnHCl) treatment. The region approximately between amino acids (aa) 81 and 137 began to be denatured by treatment with 1.5 M GdnHCl. Within this stretch, the region comprising approximately aa 81 to 90 was denatured almost completely by 2 M GdnHCl. Furthermore, the region approximately between aa 90 and 137 was denatured completely by 3 M GdnHCl. However, the C-terminal region thereafter was extremely resistant to the GdnHCl treatment. This property was not observed in PrPSc molecules of other prion strains. Denaturation of the region between aa 81 and 137 by 3 M GdnHCl significantly prolonged the incubation periods in mice compared to that for the untreated control. More strikingly, the denaturation and removal of this region nearly abolished the infectivity. This finding suggests that the conformation of the region between aa 81 and 137 of the Chandler strain PrPSc molecule is directly associated with prion infectivity.
  • Kenta Watanabe, Masato Tachibana, Satoshi Tanaka, Hidefumi Furuoka, Motohiro Horiuchi, Hiroshi Suzuki, Masahisa Watarai
    BMC MICROBIOLOGY 8 212  2008年12月 [査読有り][通常論文]
     
    Background: The cell tropism of Brucella abortus, a causative agent of brucellosis and facultative intracellular pathogen, in the placenta is thought to be a key event of infectious abortion, although the molecular mechanism for this is largely unknown. There is a higher degree of bacterial colonization in the placenta than in other organs and many bacteria are detected in trophoblast giant (TG) cells in the placenta. In the present study, we investigated mechanism of B. abortus invasion into TG cells. Results: We observed internalization and intracellular growth of B. abortus in cultured TG cells. A monoclonal antibody that inhibits bacterial internalization was isolated and this reacted with heat shock cognate protein 70 (Hsc70). Depletion and over expression of Hsc70 in TG cells inhibited and promoted bacterial internalization, respectively. IFN-gamma receptor was expressed in TG cells and IFN-gamma treatment enhanced the uptake of bacteria by TG cells. Administering the anti-Hsc70 antibody to pregnant mice served to prevent infectious abortion. Conclusion: B. abortus infection of TG cells in placenta is mediated by Hsc70, and that such infection leads to infectious abortion.
  • Takada N, Horiuchi M, Sata T, Sawada Y
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 70 11 1225 - 1230 11 2008年11月 [査読有り][通常論文]
  • Chang-Hyun Song, Hidefumi Furuoka, Chan-Lan Kim, Michiko Ogino, Akio Suzuki, Rie Hasebe, Motohiro Horiuchi
    JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY 89 6 1533 - 1544 2008年06月 [査読有り][通常論文]
     
    It is well known that anti-prion protein (PrP) monoclonal antibodies (mAbs) inhibit abnormal isoform PrP (PrPSc) formation in cell culture. Additionally, passive immunization of anti-PrP mAbs protects the animals from prion infection via peripheral challenge when mAbs are administered simultaneously or soon after prion inoculation. Thus, anti-PrP mAbs are candidates for the treatment of prion diseases. However, the effects of mAbs on disease progression in the middle and late stages of the disease remain unclear. This study carried out intraventricular infusion of mAbs into prion-infected mice before and after clinical onset to assess their ability to delay disease progression. A 4-week infusion of anti-PrP mAbs initiated at 120 days post-inoculation (p.i.), which is just after clinical onset, reduced PrPSc levels to 70-80% of those found in mice treated with a negative-control mAb. Spongiform changes, microglial activation and astrogliosis in the hippocampus and thalamus appeared milder in mice treated with anti-PrP mAbs than in those treated with a negative-control mAb. Treatment with anti-PrP mAb prolonged the survival of mice infected with Chandler or Obihiro strain when infusion was initiated at 60 days p.i., at which point PrPSc is detectable in the brain. In contrast, infusion initiated after clinical onset prolonged the survival time by about 8 % only in mice infected with the Chandler strain. Although the effects on survival varied for different prion strains, the anti-PrP mAb could partly prevent disease progression, even after clinical onset, suggesting immunotherapy as a candidate for treatment of prion diseases.
  • Yasuko Watanabe, Wakako Hiraoka, Yuhei Shimoyama, Motohiro Horiuchi, Mikinori Kuwabara, Osamu Inanami
    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 366 1 244 - 249 2008年02月 [査読有り][通常論文]
     
    We examined the influence of D177N (D178N in humans) mutation on the conformational stability of the S2 region of moPrP(C) with varying pHs by using the SDSL-ESR technique. The ESR spectrum of D177N at pH 7.5 was narrower than that of Y161R1, referred to as WT*. The ESR spectrum of D177N did not change when pH in the solution decreased to pH 4.0. Our results suggested that the disappearance of a salt bridge (D177-R163) induced the increase in the instability of S2 region. Moreover, the line shape of the ESR spectrum obtained from H176S neighboring the salt bridge linked to the S2 region was similar to D177N. These results indicate that the protonation of H176 is strongly associated with the stability of S2 region. These findings are important for understanding the mechanism by which the disruption of the salt bridge in the S2 region forms the pathogenic PrPSc structure in hereditary prion disease. (c) 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Ohara J, Togari T, Kurokawa A, Maeda J, Ishiguro N, Furuoka H, Horiuchi M
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 69 12 1325 - 1329 12 2007年12月 [査読有り][通常論文]
  • Fumihiko Fujii, Motohiro Horiuchi, Masayoshi Ueno, Hiroshi Sakata, Issel Nagao, Mamoru Tamura, Masataka Kinjo
    ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 370 2 131 - 141 2007年11月 [査読有り][通常論文]
     
    Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) are powerful techniques tomeasure molecular interactions with high sensitivity in homogeneous solution and living cells. In this study, we developed methods for the detection of prion protein (PrP) using FCS and FCCS. A combination of a fluorescent-labeled Fab' fragment and another anti-PrP monoclonal antibody (mAb) enabled us to detect recombinant bovine PrP (rBoPrP) using FCS because there was a significant difference in the diffusion coefficients between the labeled Fab' fragment and the trimeric immune complex consisting of rBoPrP, labeled Fab' fragment, and another anti-PrP mAb. On the other hand, FCCS detected rBoPrP using two mAbs labeled with different fluorescence dyes. The detection limit for PrP in FCCS was approximately threefold higher than that in FCS. The sensitivity of FCCS in detection of abnormal isoform of PrP (PrPsc) was comparable to that of enzyme-li, hked immunosorbent assay (ELISA). Because FCS and FCCS detect the PrP immune complex in homogeneous solution of only microliter samples with a single mixing step and without any washing steps, these features of measurement may facilitate automating bovine spongiform encephalopathy diagnosis. (c) 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Horiuchi M, Nakamitsu S
    Nihon rinsho. Japanese journal of clinical medicine 65 1513 - 1520 8 2007年08月 [査読有り][通常論文]
  • Masahide Uryu, Ayako Karino, Yukiko Kamihara, Motohiro Horiuchi
    MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 51 7 661 - 669 2007年 [査読有り][通常論文]
     
    In this study, we established Neuro2a (N2a) neuroblastoma subclones and characterized their susceptibility to prion infection. The N2a cells were treated with brain homogenates from mice infected with mouse prion strain Chandler. Of 31 N2a subclones, 19 were susceptible to prion as those cells became positive for abnormal isoform of prion protein (PrPSc) for up to 9 serial passages, and the remaining 12 subclones were classified as unsusceptible. The susceptible N2a subclones expressed cellular prion protein (PrPC) at levels similar to the parental N2a cells. In contrast, there was a variation in PrPC expression in unsusceptible N2a subclones. For example, subclone N2a-1 expressed PrPC at the same level as the parental N2a cells and prion-susceptible subclones, whereas subclone N2a-24 expressed much lower levels of PrP mRNA and PrPC than the parental N2a cells. There was no difference in the binding of PrPSc to prion-susceptible and unsusceptible N2a subclones regardless of their PrPC expression level, suggesting that the binding of PrPSc to cells is not a major determinant for prion susceptibility. Stable expression of PrPC did not confer susceptibility to prion in unsusceptible subclones. Furthermore, the existence of prion-unsusceptible N2a subclones that expressed PrPC at levels similar to prion-susceptible subclones, indicated that a host factor(s) other than PrPC and/or specific cellular microenvironments are required for the propagation of prion in N2a cells. The prion-susceptible and -unsusceptible N2a subclones established in this study should be useful for identifying the host factor(s) involved in the prion propagation.
  • Yasuko Watanabe, Osamu Inanami, Motohiro Horiuchi, Wakako Hiraoka, Yuhei Shimoyama, Fuyuhiko Inagaki, Mikinori Kuwabara
    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 350 3 549 - 556 2006年11月 [査読有り][通常論文]
     
    We analyzed the pH-induced mobility changes in moPrP(C) alpha-helix and beta-sheets by cysteine-scanning site-directed spin labeling (SDSL) with ESR. Nine amino acid residues of alpha-helix1 (HI, codon 143-151), four amino acid residues of beta-sheet1 (SI, codon 127-130), and four amino acid residues of beta-sheet2 (S2, codon 160-163) were substituted for by cysteine residues. These recombinant mouse PrPC (moPrP(C)) mutants were reacted with a methane thiosulfonate sulfhydryl-specific spin labeling reagent (MTSSL). The 1/delta H of the central (N-14 hyperfine) component (M-1 = 0) in the ESR spectrum of spin-labeled moPrPC was measured as a mobility parameter of nitroxide residues (R1). The mobilities of E145R1 and Y149R1 at pH 7.4, which was identified as a tertiary contact site by a previous NMR study of moPrP, were lower than those of D143R1, R147R1, and R150R1 reported on the helix surface. Thus, the mobility in the HI region in the neutral solution was observed with the periodicity associated with a helical structure. On the other hand, the values in the S2 region, known to be located in the buried side, were lower than those in the SI region located in the surface side. These results indicated that the mobility parameter of the nitroxide label was well correlated with the 3D structure of moPrP. Furthermore, the present study clearly demonstrated three pH-sensitive sites in moPrP, i.e., (1) the N-terminal tertiary contact site of H1, (2) the C-terminal end of H1, and (3) the S2 region. In particular, among these pH-sensitive sites, the N-terminal tertiary contact region of HI was found to be the most pH-sensitive one and was easily converted to a flexible structure by a slight decrease of pH in the solution. These data provided molecular evidence to explain the cellular mechanism for conversion from PrPC to PrPSc in acidic organelles such as the endosome. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Satoko Yamaguchi, Yoshihiro Nishida, Kenji Sasaki, Mikie Kambara, Chan-Lan Kim, Naotaka Ishiguro, Takehiro Nagatsuka, Hirotaka Uzawa, Motohiro Horiuchi
    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 349 2 485 - 491 2006年10月 [査読有り][通常論文]
     
    Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and sulfated glycans inhibit formation of the abnormal isoforrn of prion protein (PrPSc) in prion-infected cells and prolong the incubation time of scrapie-infected animals. Sulfation of GAGs is not lightly regulated and possible sites of sulfation are randomly modified, which complicates elucidation of the fundamental structures of GAGs that mediate the inhibition of PrPSc formation. To address the structure-activity relationship of GAGs in the inhibition of PrPSc formation, we screened the ability of various regio selectively O-sulfated glyco pyrano sides to inhibit PrPSc formation in prion-infected cells. Among the glycopyranosides and their polymers examined, monomeric 4-sulfo-N-acetyl-glucosamine (4SGN), and two glycopolymers, poly-4SGN and poly-6-sulfo-N-acetyl-glucosamine (poly-6SGN), inhibited PrPSc formation with 50% effective doses below 20 mu g/ml, and their inhibitory effect became more evident with consecutive treatments. Structural comparisons suggested that a combination of an N-acetyl group at C-2 and an O-sulfate group at either O-4 or O-6 on glucopyranoside might be involved in the inhibition of PrPSc formation. Furthermore, polymeric but not monomeric 6SGN inhibited PrPSc formation, suggesting the importance of a polyvalent configuration in its effect. These results indicate that the synthetic sulfated glycosides are useful not only for the analysis of structure-activty relationship of GAGs but also for the development of therapeutics for prion diseases. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Iwata N, Sato Y, Higuchi Y, Nohtomi K, Nagata N, Hasegawa H, Tobiume M, Nakamura Y, Hagiwara K, Furuoka H, Horiuchi M, Yamakawa Y, Sata T
    Japanese journal of infectious diseases 59 2 100 - 107 2 2006年04月 [査読有り][通常論文]
  • M Horiuchi, H Furuoka, N Kitamura, M Shinagawa
    JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 53 3-4 149 - 157 2006年02月 [査読有り][通常論文]
     
    The major cause of infection in animal prion diseases is thought to be consumption of prion-contaminated stuff. There is evidence that the enteric nerve system (ENS) and gut-associated lymphoid tissues (GATL) are involved in the establishment of prion infection through alimentary tract. To elucidate the initial entry port for prion, we inoculated prion to alymphoplasia (aly) mice showing a deficiency in systemic lymph nodes and Peyer's patches. The aly/aly mice were susceptible to prion infection by intra-cranial inoculation and there were no differences in incubation periods between aly/aly mice and wild-type C57BL/6J mice. Incubation periods in aly/aly mice were about 20 days longer than those in C57BL/6J mice with the intra-peritoneal inoculation. The aly/aly mice were completely resistant to prion infection by per os administration, while C57BL/6J mice were sensitive as they entered the terminal stage of disease around 300 days post inoculation. PrPSc were detected in the intestine and spleen of C57BL/6J mice inoculated with prion intraperitoneally or orally; however PrPSc was not detected in the spleen and intestine of aly/aly mice. Prion infectivity was detected in the intestines and spleens of prion-inoculated C57BL/6J mice, even after the early stages of exposure, while no infectivity was detected in these tissues of prion-inoculated aly/aly mice. No apparent differences were observed in the organization of the enteric nerve system between wild-type and aly/aly mice. These results indicate that GALT rather than ENS acts as the primary entry port for prion after oral exposure.
  • Nakamitsu S, Miyazawa T, Horiuchi M, Onoe S, Ohoba Y, Kitagawa H, Ishiguro N
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 68 1 27 - 33 1 2006年01月 [査読有り][通常論文]
  • Horiuchi M
    Nihon rinsho. Japanese journal of clinical medicine 63 12 2213 - 2220 12 2005年12月 [査読有り][通常論文]
  • O Inanami, S Hashida, D Iizuka, M Horiuchi, W Hiraoka, Y Shimoyama, H Nakamura, F Inagaki, M Kuwabara
    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 335 3 785 - 792 2005年09月 [査読有り][通常論文]
     
    The structure of the mouse prion (moPrP) was studied using site-directed spin-labeling electron spin resonance (SDSL-ESR). Since a previous NMR study by Hornemanna et al., [Hornemanna, Korthb, Oeschb, Rieka, Widera, Wuthricha, Glockshubera, Recombinant full-length murine prion protein, mPrP (23-231): purification and spectroscopic characterization, FEBS Lett. 413 (1997) 277-281] has indicated that N96, D143, and T189 in moPrP are localized in a Cu2+ binding region, Helix1 and Helix2, respectively, three recombinant moPrP mutations (N96C, D143C, and T189Q were expressed in an Escherichia coli system, and then refolded by dialysis under low pH and purified by reverse-phase HPLC. By using the preparation, we succeeded in preserving a target cystein residue without alteration of the alpha-helix structure of moPrP and were able to apply SDSL-ESR with a methane thiosulfonate spin label to the full-length prion protein. The rotational correlation times (tau) of 1.1, 3.3, and 4.8 ns were evaluated from the X-band ESR spectra at pH 7.4 and 20 degrees C for N96R1, D143R1, and T189R1, respectively. c reflects the fact that the Cu2+ binding region is more flexible than Helix1 or Helix2. ESR spectra recorded at various temperatures revealed two phases together with a transition point at around 20 degrees C in D143R1 and T189R1, but not in N96R1 With the variation of pH from 4.0 to 7.8, ESR spectra of T189R1 at 20 degrees C showed a gradual increase of tau from 2.9 to 4.8 ns. On the other hand, the pH-dependent conformational changes in N96R1 and D143R1 were negligible. These results indicated that T189 located in Helix2 possessed a structure sensitive to physiological pH changes; simultaneously, N96 in the Cu2+ binding region and D143 in Helix1 were conserved. (C) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Horiuchi M
    Uirusu 55 1 45 - 53 1 2005年06月 [査読有り][通常論文]
  • H Furuoka, A Yabuzoe, M Horiuchi, Y Tagawa, T Yokoyama, Y Yamakawa, M Shinagawa, T Sata
    ACTA NEUROPATHOLOGICA 109 3 263 - 271 2005年04月 [査読有り][通常論文]
     
    For immunohistochemistry of the prion diseases, several pretreatment methods to enhance the immunoreactivity of human and animal abnormal proteinase-resistant prion protein (PrPSc) on the tissue sections have been employed. The method of 121 degrees C hydrated autoclaving pretreatment or the combination method of 121 degrees C hydrated autoclaving with a certain chemical reagent ( formic acid or proteinase K, etc) are now widely used. We found that an improved hydrated autoclaving method at 135 degrees C, more effectively enhanced PrPSc immunoreactivity for the antibodies recognizing the linear epitope. In addition, this method was more effective for the long-term fixation samples as compared with other previous methods. However, this modified method could not retrieve PrPSc antigenic epitopes composed of conformational structures or several discontinuous epitopes. We describe the comparative studies between our improved method and other antigen-retrieval procedures reported previously. Based on the differences of reaction among the antibodies, we also discuss the mechanisms of the hydrated autoclaving methods to retrieve PrPSc immunoreactivity.
  • Kurosaki Y, Ishiguro N, Horiuchi M, Shinagawa M
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 67 3 321 - 323 3 2005年03月 [査読有り][通常論文]
  • Kataoka N, Nishimura M, Horiuchi M, Ishiguro N
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 67 3 349 - 351 3 2005年03月 [査読有り][通常論文]
  • CL Kim, A Karino, N Ishiguro, M Shinagawa, M Sato, M Horiuchi
    JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY 85 11 3473 - 3482 2004年11月 [査読有り][通常論文]
     
    The C-terminal portion of the prion protein (PrP), corresponding to a protease-resistant core fragment of the abnormal isoform of the prion protein (PrPSc), is essential for prion propagation. Antibodies to the C-terminal portion of PrP are known to inhibit PrPSc accumulation in cells persistently infected with prions. Here it was shown that, in addition to monoclonal antibodies (mAbs) to the C-terminal portion of PrP, a mAb recognizing the octapeptide repeat region in the N-terminal part of PrP that is dispensable for PrPSc formation reduced PrPSc accumulation in cells persistently infected with prions. The 50% effective dose was as low as similar to 1 nM, and, regardless of their epitope specificity, the inhibitory mAbs shared the ability to bind cellular prion protein (PrPC) expressed on the cell surface. Flow cytometric analysis revealed that mAbs that bound to the cell surface during cell culture were not internalized even after their withdrawal from the growth medium. Retention of the mAb-PrPC complex on the cell surface was also confirmed by the fact that internalization was enhanced by treatment of cells with dextran sulfate. These results suggested that anti-PrP mAb antagonizes PrPSc formation by interfering with the regular PrPC degradation pathway.
  • Gombojav A, Ishiguro N, Horiuchi M, Shinagawa M
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 66 10 1293 - 1295 10 2004年10月 [査読有り][通常論文]
  • CL Kim, A Umetani, T Matsui, N Ishiguro, M Shinagawa, M Horiuchi
    VIROLOGY 320 1 40 - 51 2004年03月 [査読有り][通常論文]
     
    We established a panel of monoclonal antibodies (mAbs) against prion protein (PrP) by immunizing PrP gene-ablated mice with the pathogenic isoform of prion protein (PrPSc) or recombinant prion protein (rPrP). The mAbs could be divided into at least 10 groups by fine epitope analyses using mutant rPrPs and pepspot analysis. Seven linear epitopes, lying within residues 56-90, 119-127, 137-143, 143-149, 147-151, 163-169, and 219-229, were defined by seven groups of mAbs, although the remaining three groups of mAbs recognized discontinuous epitopes. We attempted to examine whether any of these epitopes are located on the accessible surface of PrPSc. However, no mAbs reacted with protease-treated PrPSc purified from scrapie-affected mice, even when PrPSc was dispersed into a detergent-lipid protein complex, to reduce the size of PrPSc aggregates. In contrast, denaturation of PrPSc by guanidine hydrochloride efficiently exposed all of the epitopes. This suggests that any epitope recognized by this panel of mAbs is buried within the PrPSc aggregates. Alternatively, if the corresponding region(s) are on the surface of PrPSc, the region(s) may be folded into conformations to which the mAbs cannot bind. The reactivity of a panel of mAb also showed that the state of PrPSc aggregation influenced the denaturation process, and the sensitivity to denaturation appeared to vary between epitopes. Our results demonstrate that this new panel of well-characterized mAbs will be valuable for studying the biochemistry and biophysics of PrP molecules as well as for the immuno-diagnosis of prion diseases. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • MH Watarai, S Kim, J Erdenebaatar, S Makino, M Horiuchi, T Shirahata, S Sakaguchi, S Katamine
    JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE 198 1 5 - 17 2003年07月 [査読有り][通常論文]
     
    The products of the Brucella abortus virB gene locus, which are highly similar to conjugative DNA transfer system, enable the bacterium to replicate within macrophage vacuoles. The replicative phagosome is thought to be established by the interaction of a substrate of the VirB complex with macrophages, although the substrate and its host cellular target have not yet been identified. We report here that Hsp60, a member of the GroEL family of chaperonins, of B. abortus is capable of interacting directly or indirectly with cellular prion protein (PrPC) on host cells. Aggregation of PrPC tail-like formation was observed during bacterial swimming internalization into macrophages and PrPC was selectively incorporated into macropinosomes containing B. abortus. Hsp60 reacted strongly with serum from human brucellosis patients and was exposed on the bacterial surface via a VirB complex-associated process. Under in vitro and in vivo conditions, Hsp60 of B. abortus bound to PrPC. Hsp60 of B. abortus, expressed on the surface of Lactococcus lactis, promoted the aggregation of PrPC but not PrPC tail formation on macrophages. The PrPC deficiency prevented swimming internalization and intracellular replication of B. abortus, with the result that phagosomes bearing the bacteria were targeted into the endocytic network. These results indicate that signal transduction induced by the interaction between bacterial Hsp60 and PrPC on macrophages contributes to the establishment of B. abortus infection.
  • Gombojav A, Shimauchi I, Horiuchi M, Ishiguro N, Shinagawa M, Kitamoto T, Miyoshi I, Mohri S, Takata M
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 65 3 341 - 347 3 2003年03月 [査読有り][通常論文]
  • Gombojav A, Ishiguro N, Horiuchi M, Serjmyadag D, Byambaa B, Shinagawa M
    The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 65 1 75 - 81 1 2003年01月 [査読有り][通常論文]
  • Y Naya, M Horiuchi, N Ishiguro, M Shinagawa
    JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY 51 2 345 - 349 2003年01月 [査読有り][通常論文]
     
    Bacterial tests were used to assess bacterial contamination of game meat from Japanese wild boars. The bacterial contamination of wild boar meat was less than that of domestic pork, as determined by aerobic plate counts (APC) and coliform counts. None of the meat examined in this study was contaminated by Salmonella or E coli O-157. To detect adulteration by domestic pig meat or European wild boar meat, 46 samples of game meat sold as Japanese wild boar were examined genetically. A total of 17 samples showed genetic haplotypes of European and Asian domestic pigs in the D-loop of mitochondrial DNA (mtDNA), and 16 samples showed nuclear glucosephosphate isomerase-processed pseudogene (GPIP) genotypes of European domestic pigs. The European GP/P genotypes of these samples were confirmed by PCR-RFLP analysis. These results indicate that some game meat sold as Japanese wild boar is adulterated by cross-breeding between pigs and wild boars or by contamination with meat from domestic pigs or European wild boars.
  • N Ishiguro, Y Naya, M Horiuchi, M Shinagawa
    ZOOLOGICAL SCIENCE 19 11 1313 - 1319 2002年11月 [査読有り][通常論文]
     
    To distinguish pig-wild boar crossbred Inobuta from Japanese wild boar populations, a genetic method by using mitochondrial DNA (mtDNA) haplotypes and the nuclear glucosephosphate isomerase-processed pseudogene (GPIP) was developed. Sixteen mtDNA haplotypes from 152 wild boars from Kyushu, Shikoku and Honshu islands of Japan were distinct from those from Asian and European domestic pigs. Five alleles of GPIP were classified into two groups: 1) alleles GPIP*1, GPIP*3 and GPIP*3a from Japanese wild boars, Asian wild boars and domestic pigs; 2) alleles GPIP*4 and GPIP*4a from European wild boars and domestic pigs. An extensive genetic survey was done to distinguish the crossbred Inobuta from 60 wild boars hunted on Tsushima Island, Goto Islands, and Nagasaki and Ooita Prefectures. The mtDNA haplotypes from the 60 samples showed Japanese wild boars, but four wild boar samples from Nagasaki Prefecture had the European GPIP allele, GPIP*4. These results showed that nuclear DNA polymorphism analysis is useful, in addition to mtDNA haplotype assay, to detect "Inobuta" having the European genotype from Japanese wild boar populations.
  • M Horiuchi, T Nemoto, N Ishiguro, H Furuoka, S Mohri, M Shinagawa
    JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 40 9 3421 - 3426 2002年09月 [査読有り][通常論文]
     
    Due to the apparent absence of an agent-specific nucleic acid genome, scrapie strains cannot be classified by genome characterization, which is commonly used for the classification of many viruses. However, scrapie strains can be distinguished to some extent by biological properties such as transmissibility to experimental animals and distribution of neuropathological lesions and by biochemical properties such as the molecular mass and relative protease-resistance of the disease-specific isoform of prion protein (PrPSc). In order to preliminarily characterize the scrapie strains that are prevalent in Japan, we analyzed the transmissibility of sheep scrapie isolates to mice and the relative proteinase K (PK) resistance of the corresponding PrPSc. The results indicate that Japanese scrapie strains can be divided into at least three groups based on biological and biochemical properties. The first group includes isolates which cause disease in mice with an incubation period of similar to400 days and possess PrPSc with relatively high PK resistance. Isolates of the second group contain PrPSc that is highly resistant to PK digestion but transmit poorly to mice. The final group consists of isolates that cause disease in mice with an incubation period of less than 300 days and are associated with PrPSc with reduced PK resistance. Sheep scrapie has occurred sporadically in Japan since 1982, with only similar to60 officially reported cases so far. However, the diversity of scrapie strains in the field suggested by our data raises the concern that a scrapie strain similar to the parental agent of bovine spongiform encephalopathy could exist or emerge in Japan. Thus, continuous surveillance for scrapie will be required to prevent the further spread of scrapie, not only among the sheep population but also to other species, and to eliminate any potential risk of sheep scrapie to public health.
  • N Ishiguro, A Nakajima, M Horiuchi, M Shinagawa
    MAMMALIAN GENOME 13 7 365 - 372 2002年07月 [査読有り][通常論文]
     
    Many copies of nuclear counterparts of mitochondrial DNA (mtDNA) were found in nuclear DNA from sperm heads of the domestic dog, Canis familiaris, by DNA-DNA hybridization and DNA sequencing. Nuclear counterparts homologous to the mtDNA D-loop region were cloned into lambda phage vectors (EMBL4 and lambdagt11), and nucleotide sequences of seven different mtDNA pseudogenes were then determined. The seven pseudogenes were E3 (474 bp; 82% homology with canine mtDNA), E13 (1867 bp; 67%), 8B (2375 bp; 78%), 12A (2650 bp; 79%), 33 (4131 bp; 86%), 47 (4251 bp; 86%), and E17 (5721 bp; 71%). These seven mtDNA pseudogenes corresponded to portions of cytoplasmic mtDNA containing the genes ile, ND1, leu, 165 rRNA, val, 12S rRNA, phe, D-loop, pro, thr, cytb, and glu. A neighbor-joining phylogenetic tree constructed from 125 rRNA sequences in mtDNA pseudogenes 813, 33, 47, and E17 and in 10 mtDNA fragments from other species showed that these four pseudogenes form a monophyletic clade with canine mtDNA. A neighbor-joining phylogenetic tree based on the 318-bp cytb region showed that the canine pseudogenes existed before the divergence of 17 related canids, and their divergence dates were calculated at around 4.4 to 8.6 million years ago.

その他活動・業績

  • 小原 次郎, 戸苅 哲郎, 黒川 彩, 前田 潤子, 石黒 直隆, 古岡 秀文, 堀内 基広 The journal of veterinary medical science 69 (12) 1325 -1329 2007年12月25日 [査読無し][通常論文]
     
    スクレイピーに抵抗性のPrP遺伝子型を有するヒツジの選抜は,反芻動物の伝達性海綿状脳症の制圧対策の一つである.日本における肉用種のヒツジのPrP遺伝子型を調査した結果,主要な肉用種であるサフォーク種の約半数はスクレイピー感受性のAQ/AQもしくはAQ/VQ遺伝子型を有していた.また,スクレイピー高感受性を付与するVQハプロタイプがポールドーセット種でも認められた.スクレイピー抵抗性のPrP遺伝子型を持つ種雄を用いて選抜育種を実施した結果,3年間でスクレイピー抵抗性のヒツジの割合が50%以下から80%に増加した.しかし,スクレイピー抵抗性の羊の割合をより高くするためには,AR/ARを有する種雄の使用と雌羊の選抜が必要である.
  • 堀内 基広 臨床とウイルス 35 (4) 293 -300 2007年10月10日 [査読無し][通常論文]
  • 中満 智史, 堀内 基広 臨床とウイルス 35 (4) 301 -310 2007年10月10日 [査読無し][通常論文]
  • 前田 潤子, Hongbo Ma, Sun Hong, Chuangwen Ke, 高木 弘隆, 倉根 一郎, 堀内 基広, 高島 郁夫, 前田 秋彦 衞生動物 57 (0) 2006年06月01日 [査読無し][通常論文]
  • 中満 智史, 宮沢 孝幸, 堀内 基広, 尾上 貞雄, 大場 恵典, 北川 均, 石黒 直隆 The journal of veterinary medical science 68 (1) 27 -33 2006年01月25日 [査読無し][通常論文]
     
    プリオン遺伝子(PRNP)多型およびPRNP多型と牛海綿状脳症(BSE)に対する感受性との関係を調査する目的でホルスタイン863頭, 黒毛和牛186頭, BSE感染牛6頭に関してPRNPの蛋白質コード領域とPRNPの上流領域2箇所についてDNA多型解析を行った.PRNPのコード領域では, 塩基番号234番と576番の一塩基置換, オクターリピートの多型が検出されたが, 新たなアミノ酸置換を伴う多型は検出されなかった.上流域では23塩基の挿入/欠失とイントロン1の発現調節部位に位置する12塩基の挿入/欠失部位の多型を検査した.23塩基の挿入/欠失はBSE発症と関連すると報告されているが, 今回の解析では関係はみられなかった.ホルスタインと黒毛和牛間でアリル頻度の違いが, 23塩基と12塩基の挿入/欠失部位, 234番と576番の一塩基部位で検出されたが, オクターリピート部位では検出されなかった.研究室保存のDNAサンプル中に288塩基対(96アミノ酸)を内部欠失しているPRNPが検出されたが, 今回調査した1049頭の中には検出されなかった.今回の結果は牛のPRNPの多型と分布を知る上で貴重なデータを提供するものと思われる.
  • 堀内 基広 ウイルス 55 (1) 45 -53 2005年06月30日 [査読無し][通常論文]
  • 堀内 基広 Virus report 2 (1) 20 -27 2005年06月 [査読無し][通常論文]
  • 黒崎 恭久, 石黒 直隆, 堀内 基広, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 67 (3) 321 -323 2005年03月25日 [査読無し][通常論文]
     
    PrP遺伝子多型はヒツジやヤギのスクレイピーの自然および実験感染例での感受性や潜伏期間に影響を与える主要な要因の一つである.日本のヤギのPrP遺伝子多型を知る目的で, 118頭のヤギを解析し, 8種類の対立遺伝子と19種類の遺伝子型を得た.アミノ酸多型部位は新しい127, 146, 211を含め102, 142, 143, 240の7箇所に検出された.スクレイピーの抵抗性に関与する142Metと143Argのアミノ酸多型は日本のヤギでは少なかった.
  • 片岡 那津見, 西村 昌数, 堀内 基広, 石黒 直隆 The journal of veterinary medical science 67 (3) 349 -351 2005年03月25日 [査読無し][通常論文]
     
    十勝地方で捕獲されたエゾシカ136頭について慢性消耗病(CWD)の汚染状況をウエスタンブロット法で調査した.CWD感染時に検出される異常プリオン蛋白質はどの検体からも検出されなかった.エゾシカのプリオン遺伝子の多型解析の結果, DNA置換は塩基番号63, 225, 408で検出されたが, アミノ酸多型は検出されなかった.このことは, 十勝地方のエゾシカは遺伝的に均一であり, CWDに汚染されていないことを示す.
  • 堀内 基広 膜 30 (2) 78 -83 2005年03月01日 [査読無し][通常論文]
  • GOMBOJAV Altangerel, 石黒 直隆, 堀内 基広, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 66 (10) 1293 -1295 2004年10月25日 [査読無し][通常論文]
     
    モンゴルで飼育されている9品種740頭の羊から血液を採取し染色体DNAを分離した.PCRでPrP遺伝子コード領域を増幅し,direct sequencingにより塩基配列を決定した.コドン112,136,154及び171におけるアミノ酸多型に着目して解析を行い9品種の羊740頭から7つのPrP対立遺伝子と16の遺伝子型をみつけた.スクレイピー抵抗性の遺伝子型であるコドン17lArg/Argを有する羊が全体の1.8%,スクレイピー感受性のコドン171Gln/Glnを有する羊が82.6%存在した.コドン127のvalとSer,及び189のLeuとArgのアミノ酸多型は8種の羊で見つかった.このアミノ酸多型はモンゴルの羊に共通の特徴であると考えられた.
  • 堀内 基広 老年精神医学雑誌 14 (12) 1488 -1494 2003年12月 [査読無し][通常論文]
  • ゴンボジャブ アルタンゲレル, 島内 育子, 堀内 基広, 石黒 直隆, 品川 森一, 北本 哲之, 三好 一郎, 毛利 資郎, 高田 益宏 The journal of veterinary medical science 65 (3) s・x, 341 -347 2003年03月25日 [査読無し][通常論文]
     
    羊および牛/マウスキメラPrP遺伝を発現するトランスジェニック(Tg)マウスが,羊スクレイピーモデル動物として有効であるか否かを検討した.またヒトPrP Tgマウスを用い日本の羊スクレイピーのヒトヘの感染の危険性についても検討した.作成したSh/Mo, Bo/Mo PrP TgPm^<+/+>およびTg Prnp^<0/0>マウスに羊スクレイピー野外例(KU, Y5, S2)の脳乳剤を脳内接種して発症までの潜伏期間とPrP^<Sc>の蓄積を調べた. Sh/Mo PrP TgPrnp^<+/+>マウスにKUの脳乳剤を脳内接種した場合は,発症までの潜伏期間がnon-Tgマウスに比べ短かったが, Bo/MoPrPTgPrnp^<+/+>マウスにKUの,脳乳剤を接種した場合では潜伏期間は有意に延長した.Tgマウスに羊スクレイピーS2の脳乳剤を接種した場合では,臨床症状はみられず,PrP^<Sc>も脳内からは検出されなかったことから,羊スクレイピーの実験モデルとしてのTgマウスの有用性は確認できなかった.Hu/MnPrPTgPrnp^<0/0>マウスに羊スクレイピー野外例(Y5, S2)と実験接種例(VPH-G1)のスクレイピー羊脳乳剤,およびマウススクレイピーOBIHIRO株のマウス脳乳剤を脳内接種した場合も臨床症状はみられず,PrP^<Sc>も検出されなかった.これらの結果から,羊...
  • Gombojav A, 石黒 直隆, 堀内 基広, 品川 森一, Serjmyadag D, Byambaa B The journal of veterinary medical science 65 (1) 75 -81 2003年01月25日 [査読無し][通常論文]
     
    PrP遺伝子は自然発生のスクレイピーの潜伏期間および宿主感受性に直接かかわっていると考えられている.我々はモンゴルの中部の3県,Tuv,Uvurkhangai及びSelengeの4品種(在来種のKhalkh,改良種のOrkhon,Khangai,Yeroo)271頭の羊のPrP遺伝子型を調べた.これまで知られている,コドン112,136,154及び171におけるアミノ酸多型に着目して解析を行った4種類の羊271頭から8つのPrP対立遺伝子と16の遺伝子型がみつかった.スクレイピー抵抗性の遺伝子型であるコドン171Arg/Argを有する羊が全体の1.8%,スクレイピー感受性のコドン171Gln/Glnを有する羊が66.8%存在した.スクレイピー高感受性を付与するコドン136ValはYerooおよびOrkhon種の羊でみつかった.既知の多型以外に,コドン127でVal/Ser,171Lys及び189でLeu/Argの新たなアミノ酸多型がKhalkh,YerooとOrkhon種の羊でみつかった.このことによりモンゴルの大部分の羊はスクレイピーに感受性を有していることが示唆された.
  • 池田 徹也, 堀内 基広, 古岡 秀文 食品衛生研究 52 (1) 33 -42 2002年01月 [査読無し][通常論文]
  • 堀内 基広 ウイルス 51 (2) 145 -150 2001年12月01日 [査読無し][通常論文]
  • 山本 真理, 堀内 基広, 石黒 直隆, 品川 森一, MATSUO T, KANEKO K The journal of veterinary medical science 63 (9) 983 -990 2001年09月 [査読無し][通常論文]
     
    伝達性海綿状脳症の病原体プリオンは従来の微生物不活化処理に高い抵抗性を示す.医療機器のプリオン汚染除去を目的として, 3種のエポキシ化合物, β-プロピオラクトン, プロピレンオキサイド及びグリシドール(GLD)のスクレイピープリオンに対する影響を調べた.異常プリオン蛋白(PrP^<Sc>)と抗体の反応性を指標に調べたところ, GLDが有望であった.GLDはプリオン蛋白と結合して, 小分子に断片化することがわかった.3及び5%GLDによりPBS中で室温処理により, プリオンの感染性は, 10^3以上に低下したが十分とは言えなかった.より有効に処理する条件を見いだすために, GLDの効果に及ぼすGLDの濃度, 温度, 塩, pHの影響を調べた.時間の延長と共に調べたGLD5%, 55°C, pH7.8までの範囲では, GLDの濃度, 温度およびpHは高い方が効果的であった.
  • 山田 学, 松井 高峯, 古林 与志安, 古岡 秀文, 播谷 亮, 小林 勝, 中川 辿夫 The journal of veterinary medical science 61 (7) 823 -825 1999年07月 [査読無し][通常論文]
     
    我々は牛の実験的イヌサフラン中毒において, 消化管粘膜及びリンパ造血系組織にアポトーシスで特徴的な組織像である核濃縮, 核崩壊像が出現することを報告した. 今回, イヌサフランによる細胞障害機構へのアポトーシスの関与を検討するため, 特徴的所見の得られた消化管上皮及び脾臓について断片化DNAの有無及び超微形態像を検索したところ, イヌサフランによる細胞障害機構へのアポトーシスの関与が示唆された.
  • 松下 かおり, 堀内 浩幸, 古澤 修一, 堀内 基広, 品川 森一, 松田 治男 The journal of veterinary medical science 60 (6) 777 -779 1998年06月 [査読無し][通常論文]
     
    ウシプリオンタンパク(PrP)の合成ペプチドに対するニワトリ型モノクローナル抗体を作成した.ウシPrPペプチドB204(コドン204〜220)をKLHに架橋して免疫したニワトリは, B204に対する抗体を産生した.免疫ニワトリの脾細胞と融合用ニワトリB細胞株MuH1を用いた1回の融合実験で, 19種類のB204特異的ニワトリ型モノクローナル抗体が作成できた.これらの抗体は, B204ペプチドの他4種類の10アミノ酸合成ペプチドを用いた阻害ELISAでアミノ酸配列から予想された動物間(ウシ・マウス・ヒト・ヒツジ・ハムスター)組合せからなる5群に分類できた.これらの結果は, ニワトリ型モノクローナル抗体システムは哺乳動物PrPの免疫学的解析に有用な技術であることを示唆している.
  • 堀内 基広 食肉の科学 38 (2) 205 -212 1997年12月30日 [査読無し][通常論文]
  • 品川 敏恵, 石黒 直隆, 掘内 基広, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 59 (11) 1071 -1074 1997年11月 [査読無し][通常論文]
     
    牛のTリンパ腫の約15%では, 12塩基反復配列がc-myb遺伝子に挿入されている. この配列の反復回数が細胞の培養中に増減する現象が観察された. 反復回数の変化がDNAループの修復異常で生じる可能性を探るため, 蛋白のDNAループ結合能と修復能を調べたが, 調査した全ての細胞株で両方の活性が検出された. これらの結果は, 12塩基反復配列の不安定性がDNAループの修復機能と無関係である可能性を示唆している.
  • 井上 真吾, 田中 成幸, 堀内 基広, 石黒 直隆, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 59 (3) 175 -183 1997年03月 [査読無し][通常論文]
     
    ウシ白血球由来のDNAから作製したゲノムライブラリーよりPrP遺伝子のプロモーター領域を含むクローンを分離し, 3,407 bpの塩基配列を決定した. ウシPrP遺伝子の5'側非コード領域のゲノム構造は3つのエクソンと2つのイントロンから成り, その構造はマウス, ラットやヒツジと同様だった. ウシPrP遺伝子の5'側隣接領域は, 転写開始部位から88塩基上流までで78%とG+Cに富み, 転写因子Sp1結合部位と思われる配列が3ヶ所存在したが, CCAAT-boxやTATA-boxは認められなかった. この領域はヒッジPrP遺伝子と高いホモロジー(89%)を示したが, マウス, ラット, ハムスターやヒトのPrP遺伝子とは比較的低い(約46-62%)ものだった. ウシPrP遺伝子の5'側隣接領域のプロモーター活性をCATアッセイにて測定した結果, -88から-30内に主要なプロモーター活性を認めたが, この領域がプロモーター活性を示すためにはイントロン1の存在が不可欠であることが判った. イントロン1を一部欠失させた遺伝子を各種導入したところ, +123から+891内にプロモーター活性に関与する領域が存在することが判った.
  • 堀内 基広, 望月 雅美, 石黒 直隆, 長澤 秀行, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 59 (2) 133 -136 1997年02月 [査読無し][通常論文]
     
    猫汎白血球減少症ウイルス中(FPLV)およびミンク腸炎ウイルス(MEV)に特異的なモノクローナル抗体(MAb)を得る目的で, MEV-網走株に対する15株のMAbを作製した. 一つのMAb P2-215はFPLVおよびMEVに特異的であったが, 残りの14のMAbはイヌパルボウイルス(CPV), FPLV, MEVすべてに反応した. CPV/MEVキメラウイルスを用いたエピトープ解析から, MAb P2-215はFPLVおよびMEVに特異的なVP2の93番目のアミノ酸リジンを含むエピトープを認識することが明らかとなった.
  • 大園 隆美, 石黒 直隆, 堀内 基広, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 58 (4) 305 -310 1996年04月 [査読無し][通常論文]
     
    2種類の牛c-myb遺伝子を得た. 1つは, 散発型牛白血病(SBL)胸腺型に由来し75kDa蛋白質(FLMyb)をコードする完全長のc-myb遺伝子であり, 他の1つはSBL子牛型に由来し, 負の制御領域に相当する85アミノ酸を内部欠損した65kDa蛋白質(DELMyb)をコードする遺伝子である. c-myb遺伝子の内部欠損とトランスフォーム能との関係を調べる目的でFLMybとDELMybをコードするレトロベクターを作製し, マウス胎児肝細胞に感染させた. DELMybの高い転写活性能にかかわらず, 半流動寒天およびメチルセルロース中でのコロニー形成能に関してDELMybとFLMybとの間には大きな差はみられなかった. このことは, c-myb遺伝子の内部欠損は転写活性能には有効であるが, 造血系細胞のトランスフォーメーションには直接関与していないことを示している.
  • Prusiner Stanley B, 堀内 基広, 品川 森一 蛋白質核酸酵素 40 (16) p2383 -2407 1995年12月 [査読無し][通常論文]
  • 堀内 基広, 山崎 典子, 古岡 秀文, 松井 高峯, 中川 迪夫, 石黒 直隆, 品川 森一 The journal of veterinary medical science 57 (3) 577 -580 1995年06月 [査読無し][通常論文]
     
    北海道十勝地方の某牧場で肥育仔牛に髄膜脳炎が散発した. 仔牛は牛伝染性鼻気管炎ウイルス生ワクチンをはじめ5種類の生ワクチンを鼻腔内噴霧されていた. 脳炎症状を呈した2頭の牛の脳から11クローンの牛ヘルペスウイルス1型を分離した. 制限酵素Pst I および Hind III によるウイルスゲノムの切断像を758-43ワクチン株のものと比較したが顕著な差は認められなかった. 従って分離株はワクチン株由来であると考えられた.
  • 品川 敏恵, 石黒 直隆, 堀内 基広, 品川 森一, 松井 高峯 日本獣医学雑誌 56 (5) 827 -833 1994年10月 [査読無し][通常論文]
     
    3種類の散発型牛白血病株, BLT2(胸腺型), BTL-PC3(仔牛型)およびBLS1(皮膚型)をマウスに免疫して作製したモノクローナル抗体(mAb) 38個を用い散発型および地方病型牛白血病に発現している抗原の分布について検討した. 多くのmAbは, 一部の牛および他の動物種由来の単核細胞を除き検索した正常牛リンパ球系細胞に対して, 低い反応性しか示さなかった. mAbのほとんどは, 自然発症例の牛散発型白血病由来末梢単核細胞よりは株化したT細胞株BTL-PC3およびB細胞株BL312とKU-1に強く反応した. 38個のmAbの内27個のmAbで認識する抗原の分子量がウエスタンブロット解析により決定された. mAbC419は, 正常リンパ系細胞には反応せず, 腫瘍化した細胞に特異的に反応することから, 牛散発型白血病細胞の腫瘍関連抗原を認識していることが示唆された.
  • 品川 敏恵, 石黒 直隆, 堀内 基広, 品川 森一 日本獣医学雑誌 56 (5) 957 -959 1994年10月 [査読無し][通常論文]
     
    散発型牛白血病細胞株に対して作製したモノクローナル抗体(mAb)38個の, ウシTリンパ腫細胞(BTL-27)の増殖に対する影響について検討した. その結果, mAB S37が著しい増殖抑制効果を示した. S37の存在下で培養した細胞は, 核の濃縮及びDNAの断片化が観察された. これにより, mAb S37はBTL-27に対しアポトーシスによる細胞死を引き起こすことが明らかとなった.
  • 小野寺 朝子, 池田 徹也, 堀内 基広, 石黒 直隆, 小沼 操, 平野 紀夫, 見上 彪, 本多 英一, 平井 克哉, 甲斐 一成, 柚木 弘之, 村松 康和, 品川 森一 日本獣医学雑誌 56 (4) 627 -632 1994年08月 [査読無し][通常論文]
     
    現在わが国におけるスクレイピーの汚染状況を把握するために, 1988年から1993年までに北海道, 東北, 関東及び中部地方から集めた主にサフォーク種の羊197頭の脳, 脾臓及びリンパ節からPrP^<sc>の検出を行った. そのうち北海道の16頭及び他地域の2頭からPrP^<sc>が検出されたが, 後者の2頭も北海道から導入された個体であった. 一方, これらの18頭のスクレイピー感染羊におけるPrP遺伝子を含む染色体DNAの制限酵素切断断片の多様性(RFLP)の各型の出現頻度を, 128頭の健康な羊における出現頻度と比較して, RFLPの特異的な型とスクレイピーの自然感染との間に相関があることを確認した. すなわちスクレイピー感染羊におけるRFLP型I型の頻度は健康な羊におけるI型の頻度や, スクレイピー感染羊における他の型の頻度に比べて有意に高くなっていた. 一方II型とVI型の頻度はスクレイピー感染羊に比べて健康な羊で高くなっていた. ゆえに日本のサフォーク種において, I型の羊はスクレイピーに対して感受性であり, II型とVI型の羊は抵抗性であることが示唆された. さらにスクレイピー感受性に関わる遺伝学的な背景を明らかにするために, 我が国における羊PrP遺伝子のRFLP型の分布を161頭の羊で調べた. 各々の地方でRFLP型の分布に若干差が認められた.
  • 品川 森一, 村松 康和, 小野寺 朝子, 松井 高峯, 堀内 基広, 石黒 直隆, 中川 迪夫 日本獣医学雑誌 55 (4) 665 -667 1993年08月 [査読無し][通常論文]
     
    24ヶ月齢で出産した2頭のコリデールヒツジが29及び30ヶ月齢で相次いで運動失調を示し起立不能に陥った. 1例目は原因不明のまま死亡し, 2例目は病理組織学的及び免疫化学的にスクレイピーと診断された. これらの子ヒツジ4頭の内, 3頭が10, 14, 及び19ヶ月齢でスクレイピーを発症した. 親子共に脱毛はなく, そう痒症状を欠いていた. 異常に短い潜伏期及びそう痒症状の欠落について考察する.
  • 堀内 基広, 児玉 洋, 見上 彪 日本獣医学雑誌 52 (5) 985 -994 1990年10月 [査読無し][通常論文]
     
    マレック病ウイルスCVI-988株 (血清型1) またはHPRS-24株 (血清型2) 感染細胞に対する単クローン性抗体を産生する24クローンの抗体産生ハイブリドーマを作製し, 単クローン性抗体の性状を間接蛍光抗体法, ウイルス中和試験, 及び免疫沈澱法により解析した. 免疫沈澱法により検出される抗原の分子量に基づいて単クローン性抗体を7群に分類し, 得られた抗体を用いてウイルス特異抗原の解析を行った. 1群及び2群に分類した抗体によって検出される抗原は, これまでに報告がないものであった. すなわち, 1群に分類した抗体により検出される抗原は, CVI-988株及び血清型2ウイルス感染細胞に存在する分子量29/34kdの糖蛋白質であった. 抗原出現の経時的変化の解析から, 本抗原は後期膜抗原に関連していることが示唆された. また, 2群に分類した抗体により検出される抗原は, 血清型2ウイルス感染細胞に存在する分子量37kd, 33kd (SB-1株では34kd) 及び31kdのポリペプチドであった. 本抗原はウイルス感染後早期から感染細胞に出現することから, 初期抗原に関連していることが示唆された. なお, 他の5群に分類した抗体は, 以前に報告があるウイルス特異抗原と類似したものと反応する抗体, 或いは抗体により検出される抗原が十分に解析されなかったものである.

共同研究・競争的資金等の研究課題

  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(A))
    研究期間 : 2011年 -2012年 
    代表者 : 堀内 基広
  • 文部科学省:科学研究費補助金(挑戦的萌芽研究)
    研究期間 : 2011年 -2011年 
    代表者 : 堀内 基広
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2009年 -2011年 
    代表者 : 稲波 修, 稲葉 睦, 堀内 基広, 桑原 幹典, 山盛 徹
     
    平成22年度は初年度で確立した部位特異的スピンラベル法による2点間距離計測技術をプリオン凝集体の構造解析に適用を広げることを目的に研究を推進した。測定系の確立は遺伝的プリオン病の変異体D178Nのαヘリックス2上のT188にスピンプローブ(R1)を導入したD178N/T188R1で行い、連続波ESRにより凝集体では1.8nmであることを明らかにした。pH4.0で1M塩酸グアニジン処理すると凝集体構造を形成することはAFMによるフィラメント構造の観察により確かめられた。本年度は引き続き解析を進め、オクタリピートの最後部分でランダムコイル構造のD178N/S97R1、αヘリックス1のD178N/D144R1、αヘリックス2のD178N/R204R1とD178N/Y225R1について同様に検討した。どの場所でも凝集体のスピン間の距離は1.5nm~2.0nmの間の値が持続波ESR法で検出された。パルスESR法でも計測範囲の短距離限界を示し、周期的で規則正しい構造ではなく、凝集体中の同じアミノ酸残基の分子間の距離は1.5nm~2.0nm程度の間隔を持つランダムに凝集体を形成している可能性を示していると類推された。既に他の研究者によって電子顕微鏡像から得られたシミュレーションでは規則正しい対称構造モデルが提唱されており、オクタリピートを除いたブリオンタンパク質凝集体の構造について、同様方...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(萌芽研究, 挑戦的萌芽研究)
    研究期間 : 2008年 -2009年 
    代表者 : 堀内 基広, 長谷部 理絵, 宋 昌鉉
     
    プリオン病治療法の確立を目的として、骨髄由来間葉系幹細胞(Bone marrow-derived Mesenchymal stem cells, MSC)のプリオン病の治療への応用について、プリオン感染マウスをモデルとして検討した。ヒト不死化MSCs(hMSCs)を、Chandler株感染マウスが初期の臨床症状を呈する接種後120日に海馬に移植した場合、非移植対照群(150±2日)と比べて潜伏期が有意に延長した(157±6日)。また、hMSCsを尾静脈から移植した場合、非移植対照群(148±6日)と比べて潜伏期が有意に延長した(158±6日)。hMSCsを移植したマウスでは、PrP^の蓄積量は対照群と比較して差は認められなかったが、空胞変性は軽度であった。従って、hMSCsはプリオンの増殖は阻害しないが、病気の進行に抑制的に働くことが明らかとなった。hMSCsはプリオン感染マウス脳内で、神経細胞様、アストロサイト様、およびオリゴデンドロサイト様の細胞に分化したが、その効率は低いことから、hMSCsの移植による潜伏期の延長は、bystander effectによるものと考えられた。hMSCsはいずれのルートで移植した場合でもプリオン病の神経病変へ移行したことから、hMSCsがプリオン病の神経病変部に移行するメカニズムを調べるために、in vitro走化試験をスクリーニン...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(A))
    研究期間 : 2006年 -2009年 
    代表者 : 堀内 基広, 落合 謙爾, 瓜生 匡秀, 大島 正伸, 稲波 修, 木村 和弘, 長谷部 理絵, 宋 昌絃, 落合 謙爾, 瓜生 匡秀, 大島 正伸, 古岡 秀文
     
    DNAマイクロアレイ法を用いて、プリオン感染早期から発現が変動する宿主遺伝子の探索を行い、発現がプリオン感染早期から上昇する遺伝子の病態機序への関与を解析した。その結果、LPSレセプターとして知られるCd14分子が病態進行に関与すること、神経保護作用を有するケモカインとして知られるCxcl10が病気の進行に抑制的に働くことを明らかにした。また、ミクログリアの活性化が病態進行に抑制的に働くことが示唆された。
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2007年 -2008年 
    代表者 : 稲波 修, 平岡 和佳子, 下山 雄平, 稲葉 睦, 堀内 基広, 桑原 幹典, 浅沼 武敏, 平岡 和佳子, 下山 雄平
     
    本研究はブリオン病の原因であるブリオンタンパク質の凝集体変化を新しい方法を用いて明らかにし、今後のプリオン病の病態解明や治療薬の評価方法を開発することを目的とした。このプリオン凝集体への変化を起こすには細胞内低pH器官であるエンドソームで起きることから、pHの低下が必須であると考えられていることからpH7.0の生理条件からpH4.0に変化させたときの構造変化を明らかにした。電子スピン共鳴法、ならびに原子間力顕微鏡を用いて家族性プリオン病でよく見られる変異体プリオンD177NはpH4.0、変性下に置くことで変異を持っていない野生型よりも効率よく線維状の凝集体が起きることが示され。凝集の引き金となる領域がタンパク中心部のβシート付近にあることが明らかとなった。今回の結果はプリオン病の原因タンパク質の構造変化を明らかにしただけでなく、今回用いた新たな方法はプリオン関連病の治療薬の評価系に用いることが可能であると考えられる。
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2005年 -2007年 
    代表者 : 石黒 直隆, 丸尾 幸嗣, 柳井 徳磨, 桑田 一夫, 堀内 基広
     
    動物プリオン病は感染した宿主により病態が異なる。本研究では、こうした病態の違いが、宿主が有する神経系と免疫系に依存するものと考えPrP遺伝子解析、ウシとヒツジの回腸に投射している外来性神経網の解析、免疫系細胞でのプリオンの蓄積・分解能を解析し以下の成果を得た。1.ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカのPrP遺伝子型解析:プリオンに対する感受性を支配するPrP遺伝子の多型解析を行った。ウシとシカではPrP遺伝子内にアミノ酸置換を示す多型は検出されなかった。日本のヤギではスクレイピーに対して感受性が高い遺伝子型が多く検出された。ヒツジではスクレイピーに抵抗性を示す遺伝子型が多く検出されつつある。2.トレーサを用いたウシとヒツジでの腸管神経網の解析:ウシとヒツジの回腸遠位部にトレーサを注入し、腸管の神経網を解析した。その結果、腹腔・前腸間膜動脈神経節と脊髄神経節で多くの陽性細胞を得た。幹神経節や迷走神経での陽性細胞は少なかった。回腸にトレーサを注入した揚合は、ウシとヒツジで同様な結果を得た。一方、十二指腸にトレーサを注入した実験では、迷走神経背側核と節状神経節に陽性細胞が検出され、その傾向はヒツジで特に顕著であった。3.免疫系細胞でのプリオンの取り込みと分解性:BSE感染牛では回腸パイエル板内の濾胞マクロファージ内でプリオンの蓄積が検出されている。そこで、ウシ末梢血由来の単球培養系マクロファー...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2005年 -2006年 
    代表者 : 稲波 修, 堀内 基広, 苅和 宏明, 稲葉 睦, 桑原 幹典
     
    BSEやCJDなどのプリオン病では、構造異常を呈する異常型プリオンタンパク質(PrPSc)が正常型PrPCと相互作用し、その高次構造を異常型に変換させ、病態を引き起こすと考えられている。このPrPの構造変化機構には、酸性エンドソームが関与していると考えられている。本研究ではsite-directed spin labeling (SDSL)法を用い、αヘリックス1(H1)の裏側、βシート1(S1)とβシート2(S2)の3つのpH感受性領域をESRによる解析で見出した。近年、molecular dynamics (MD) simulationを用いた研究により、酸性pHが引き起こすPrPSc様のβ-sheet-rich構造への転換にアスパラギン酸177(Dl77)とヒスチジン186(H186)が重要な役割を持つと報告されたが、実際には実験的な証明はなされていない。本研究ではさらにD177とR163が形成する塩橋とH176とH186の2つのヒスチジン残基について、β-sheet2(S2)のpH感受性に対する影響をSDSL-ESR法で解析した。その結果、D177が形成する塩橋の形成がS2の中性付近でのβシート構造の維持に重要であることが明らかとなったが、近傍のH176の存在がこの構造安定性にも重要であることが見いだされた。また、H186のCJD変異についてはS2の構造安定化には寄与...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(A))
    研究期間 : 2004年 -2006年 
    代表者 : 稲葉 睦, 山本 雅之, 陰山 聡一, 堀内 基広, 稲波 修, 梅村 孝司
     
    1)AHSP遺伝子の5'上流領域プロモーター領域の解析から、赤芽球系分化誘導時には、翻訳開始点上流-328〜-286bpに位置する3カ所の転写因子GATA結合モチーフがAHSPの転写活性化に必要な最小要素であることが明らかになった。EMSA解析等の結果を加え、赤芽球系前駆細胞におけるAHSPの転写にはGATA-1の作用が必須なことが明らかになった。同時に、PrP^侵襲によるAHSPの発現抑制には、GATA-1による転写制御が関連することが推定された。2)プリオン感染マウス由来脳乳剤、あるいはPrP^持続感染神経細胞株ScN2a存在下にMELhide8細胞を培養し、AHSP等の発現を解析した。しかし、赤芽球系分化誘導時、AHSPをはじめ、α-グロビン、β-グロビン、GATA-1、EKLF、NF-E2などの転写にはいずれも何ら影響が認められず、また、長期継代後にもMELhide8細胞にはPrP^の蓄積が全くみられなかった。これらの結果から、PrP^はMELhide8細胞に対する直接作用をもたないことが明らかになった。3)MELhide8細胞におけるAHSP mRNA発現量、ならびに上記GATA依存性のAHSPプロモーターレポーター遺伝子発現は、IL-6の添加で濃度依存性に抑制された。IL-1βにも類似作用が認められたが、その効果はIL-6に比して低...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2004年 -2006年 
    代表者 : 西田 芳弘, 小林 一清, 三浦 佳子, 堀内 基広, 鵜沢 浩隆
     
    ヘパラン硫酸は細胞外マトリックスとして細胞の増殖や分化に重要な役割をしている。また、正常プリオンから異常プリオン蛋白質への転移に係ると考えられているが、複雑な構造を持つことから明確な構造因子(鍵構造)を抽出することができなかった。本研究では、代表者らの糖鎖モジュール化法をグリコサミノグリカン類、特に、ヘパラン硫酸に適用して、構造が明確な硫酸化多糖を合成すること、さらに、合成品をプリオン感染細胞並びにモデルマウスを用いた生物試験に供して、抗プリオン活性を示すグリコサミノグリカンの活性糖の構造因子を明らかにすることを目的とした。その結果、以下のことを明らかにすることができた。(1)各種硫酸化糖モノマー(モジュラー)を酵素と化学的手法を用いて合成する方法論を確立した。さらに、アクリルアミドのラジカル重合により、ポリアクリルアミド鎖にパラニトアミドフェニル基を介して複数の硫酸化糖が結合した人工ヘパラン硫酸を合成することができた。(2)持続感染細胞を用いた評価で、ヘパラン硫酸の主要な構成糖である6-sulfo-GlcNAcの人工高分子に抗プリオン活性が確認された(ED_<50> 10Dg/ml)。硫酸基を持たないGlcNAcの高分子には活性が認められなかった(ED_<50>>80Dg/ml)ことから硫酸基が活性に必須であることが明確になった。4-sulfo-GlcNAcの高分子はさらに...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2004年 -2006年 
    代表者 : 鈴木 正嗣, 梶 光一, 山内 貴義, 有川 二郎, 横山 真弓, 堀内 基広, 木村 享史
     
    1.ニホンジカ(976頭)とニホンイノシシ(87頭)から得た血清を用い,ELISA法とウエスタンブロット法によりE型肝炎に対する血清学的診断を行った.その結果,それぞれの種で2.6%および2.3%が抗体陽性と判断された.イノシシにおいては,RT-PCR法により3頭でHEV-RNAが確認されたが,捕獲状況からこれらは同腹子と考えられた2.野生のニホンイノシシ(88頭)から得た血清を用い,ELISA法と顕微鏡下凝集試験(MAT)により,レプトスピフに対する抗体の検出を行った.その結果,12検体(13.6%)が抗体陽性と判断され,さらにMATでは血清型copenhageni, australis, bratislavaの抗体が検出された.そのため,捕獲ならびに解体にともなう人や猟犬に対する感染リスクが示唆された.3.野生のニホンジカ173頭を材料に,糞便培養法,LAMP法,nested PCR法によりヨーネ菌の検出を試みた.その結果,糞便培養法では菌は確認されなかった.また,LAMP法とnested PCR法でもヨーネ菌DNAは検出されなかった.4.北海道産の野生ニホンジカ(エゾシカ)においては,末梢血よりRickettsia helveticaとEhrlichiamurisの遺伝子が確認された.5.岩手県で捕獲された野生ニホンジカからは,槍形吸虫Dicrocoelium chin...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(萌芽研究)
    研究期間 : 2004年 -2005年 
    代表者 : 西田 芳弘, 小林 一清, 三浦 佳子, 小川 智久, 堀内 基広
     
    硫酸化ペントサン、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンや硫酸多糖体がプリオンの増殖阻害活性を有することは古くから知られている(Ehlers & Diringer, J Gen Virol.,65:1325-1330,1984. Caughey & Raymond, J Virol.,67:643-650,1993.)。これらは、長年にわたり、プリオン病治療法への応用が期待されてきたが、現在まで、硫酸多糖体を使用したプリオン病治療法は確立されていない。天然の硫酸多糖体は硫酸化やアセチル化の部位や割合などが制御されていないため、硫酸多糖体の構造とプリオン増殖阻害活性の構造活性相関の解析が困難である。プリオン増殖阻害活性を担う硫酸化糖の基本骨格が明らかになれば、これをリード化合物として、新たなプリオン病治療薬が創出できる可能性がある。そこで、本研究では、硫酸化部位を正確に制御した合成硫酸化糖を研究代表者の糖鎖モジュール化法を適用することで合成を行い、硫酸化糖の構造とプリオン増殖阻害活性の関係について解析することを目的とした。(1)合成硫酸化糖によるプリオン増殖阻害試験プリオン持続感染細胞I3/I5-9は、10%FBSを含むOpti-MEM(Invitorgen)で培養した。硫酸化糖はMili-Qに溶解して、使用直前に0.45μmのフィルターで濾過滅菌した。硫酸化糖を加え2日間培養した...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(A))
    研究期間 : 2003年 -2005年 
    代表者 : 堀内 基広, 古岡 秀文, 大橋 和彦, 稲葉 睦, 前田 秋彦
     
    本研究では、PrP^産生を阻害する物質の作用機序の解析、および、プリオン増殖に関与する宿主因子や微小環境の同定、からプリオンの細胞内増殖機構を紐解くための研究を行った。細胞膜上に発現するPrP^Cと反応する4種の抗PrP抗体が、プリオン持続感染細胞におけるPrP^産生を抑制した。細胞膜上のPrP^Cと結合した抗体は細胞膜上に停留する傾向があることから、PrP^Cと抗体が結合して、PrP^Cが通常の分解経路に移行しなくなることが、PrP^産生抑制の原因と考えられた。また、人工硫酸化糖のプリオン増殖抑制能を調べた結果、4-Sulfo-N-acetylglucosamineおよび6-Sulfo-N-acetylglucosamineにPrP^産生抑制活性が認められた。これらを細胞に添加した場合、PrP^Cのエンドサイトーシスが促進され、総PrP^C量が減少した。一方、PrP^産生抑制活性のない硫酸化糖はPrP^Cのエンドサイトーシスを促進しなかった。従って硫酸化糖によるPrP^産生抑制は、PrP^Cの分解促進が原因と考えられた。マウス神経芽細胞Neuro2aのサブクローンを多数樹立して、プリオン感受性および非感受性に分類した。プリオン非感受性のN2a-1ではPrP^Cの発現は親株やプリオン感受性N2aサブクローンと同程度であった。プリ...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(萌芽研究)
    研究期間 : 2002年 -2003年 
    代表者 : 古岡 秀文, 品川 森一, 堀内 基広, 松井 高峯, 古林 与志安
     
    (1)プリオン蛋白の免疫組織化学的検出感度に関する研究昨年度までに開発した免疫組織化学的高感度法とWB法の感度の比較を行った.スクレイピー帯広株脳内接種マウスを用いて経時的なプリオン蛋白の検出により比較を行った.WB法では30日目で脾臓に,60〜90日目に中枢神経系に異常プリオン蛋白が検出できた.一方,免疫組織化学的には脾臓は90日目,中枢神経系では120日目に検出可能であった.WB法ではマウス脾臓全量からの検出であるのに対して,免疫組織化学では約5μmの組織切片を使うことから単純な感度比較はできないが,免疫組織化学的方法は検出感度の点ではWB法に比較して劣ることが明らかになった.定量的な解析は現在実施中である.(2)パネル抗体による免疫組織化学コアエピトープに関する研究市販されている抗体を含め,これまでに開発された17種類の抗体を用いて,抗体の種特異性について,抗体エピトープと動物種間のアミノ酸配列との関連から検討した.動物種のアミノ酸配列と抗体エピトープの不一致が抗体の種特異性を規定する場合と規定しない場合があった.特異性を規定しない場合には,動物種間差でみられるいくつかのアミノ酸の違いは反応性を左右しない.しかしながら,アミノ酸一つの違いが動物種差としての特異性を規定する場合や,同じ領域を認識する抗体にも反応性に差がみられた.このことから,免疫組織化学的抗原抗体反応は抗...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(C))
    研究期間 : 2002年 -2002年 
    代表者 : 片峰 茂, 堂浦 克美, 金子 清俊, 小野寺 節, 福岡 伸一, 堀内 基広
     
    本邦におけるプリオン研究者の情報交換の促進と将来の共同研究プロジェクト立ち上げのための準備を目的に本研究を遂行した。情報交換に関しては、平成14年10月21日に長崎において班会議を開催し、班員に加えて数名の内外のプリオン研究者による情報交換と討議の場をもった。その結果、個々の班員間の往来及び研究材料の共有などのいくつかの実が挙がっている。例えば、片峰と小野寺は各々が開発したプリオン蛋白遺伝子に関わる遺伝子改変マウスと培養細胞株を共有することにより、プリオン病神経変性の機構解明へ向けた共同研究の進展が図られた。準備研究に関しては、プリオン研究進展に極めて大きな意味をもつ種々のモデル動物、細胞株、抗体、解析システムの開発が行われ、将来の大型共同研究プロジェクトへの準備は整ったと考えられる。以下に特筆される成果を挙げる。(1)プリオン持続感染細胞株の樹立(片峰)(2)プリオン類似蛋白(Dpl)遺伝子トランスジェニックマウスの樹立(片峰)(3)プリオン蛋白(PrP)と相互作用をする分子の同定法の開発(堂浦)(4)異常プリオン蛋白(PrPSc)に特異的立体構造を認識する抗体の確立(堀内)(5)不死化によるPrP欠損神経細胞株の樹立(小野寺)(6)PrPの細胞内挙動の顕微鏡下での追跡法の確立(金子)(7)タンパク質の2次構造変換定理の発見(柳川)(8)微量核酸(RNA)同定法の開発(福岡...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(C))
    研究期間 : 2000年 -2002年 
    代表者 : 堀内 基広, 田邊 茂之, 古岡 秀文
     
    本研究では、スクレイピーやBSEの自然状態での主な感染経路である経口感染において、プリオンの侵入門戸を明らかにする目的で、リンパ節やパイエル板など二次リンパ系組織を欠く変異マウス[ALY(alymphoplastic)マウス]と、その野生型であるC57BL/6マウスを用いて、腸管付随リンパ装置が侵入門戸となる可能性について調べた。ALY/ALYマウスおよびその野生型マウスC57BLに、マウススクレイピー病原体を経口、腹腔、および脳内の各ルートで投与して、スクレイピーに対する感受性を調べた。脳内接種ではC57BLは165±5日、ALYでは159±8日でマウスはスクレイピー末期となった。マウス間で有意差は認められなかった。腹腔内接種ではC57BLは251土9日、ALYでは279±6日でマウスはスクレイピー末期となり、ALYマウスで20日程度潜伏期が延長した。経口投与ではC57BLは307±7日でスクレイピー末期となったが、ALYマウスは投与後640日でもスクレイピーを発症しなかった。っまり、ALYマウスは経口ルートではプリオンに感染しなかった。また、経口投与、および腹腔投与後20,40,80日でマウスの消化管、脾臓を採取して、各時点における組織中の感染価をマウスバイオアッセイにて調べた結果、C57BL/6マウスでは調べた全ての時点でプリオン感染価が検出されたが、ALYマウスでは検...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2000年 -2002年 
    代表者 : 品川 森一, 堀内 基広, 堀内 基広, 石黒 直隆, 村松 康和
     
    モンゴルは牧羊に関して悠久の歴史を有し、羊の飼育頭数は1200万頭にのぼる。同国は将来、世界の畜産物供給基地にも成りえる可能性を有する。従って、モンゴルにおける家畜プリオン病の疫学調査は、同国の畜産物の安全性を調べる上で重要な知見をもたらすと考えらえる。研究期間中にモンゴル中央部、西部、および東部に赴き、羊スクレイピーの臨床症状などを説明し、該当する羊の存在について聞き取り調査を行なったが、スクレイピーを疑う症状を呈する羊に関する情報は得られなかった。同時に、現地獣医師に神経症状を呈した羊の延髄の採取を依頼した。回収した試料からウエスタンブロットにより異常型プリオン蛋白質(PrPSc)の検出を行なったが、全て陰性であった。回収できた試料の数は十分ではないが、モンゴルにおけるスクレイピーの存在を確認するには至らなかった。モンゴル各地で、9品種(Khalkh、Yeroo、Orkhon、Khangai、Sartuul、Govi-altai、Bayad、Darhad、Sumber-Karakul)、計470頭の静脈血を採取して、有核細胞から染色体DNAを回収した。PCRによりPrP遺伝子の蛋白質コード領域を増幅してPrP遺伝子の塩基配列を解析し、最終的にPrPアミノ酸型を決定した。PrPコドン171のGln/Argのアミノ酸多型はスクレイピー感受性/抵抗性を規定することが知られている...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 2000年 -2002年 
    代表者 : 品川 森一, 牧野 壮一, 牧野 壮一, 堀内 基広, 古岡 秀文
     
    異常型プリオン蛋白質(PrPSc)は感染因子プリオンの主要構成要素であり、その生成機構はプリオン病病因論の中心となる。プリオン(PrPSc)が外部から侵入すると、正常型プリオン蛋白質(PrPC)と会合して、PrPCをPrPScに転換する。この際、PrPScは鋳型(seed)として働く。本研究では、PrScをseedとするPrPSc生成過程におけるPrPCとPrPScの分子間相互作用を解析した。マウスとハムスターのPrPを用いて、同種のPrPCとPrPScの組み合わせではPrPCはPrPScに転換するが、異種の組み合わせでは転換効率が非常に悪かった。しかしPrPCは異種PrPScと結合し得た。関連する一連の実験結果から、PrPScへの構造転換は、PrPCとPrPScの結合の段階ではなく、主に結合後の構造転換の段階で規定されること、構造転換の宿主特異性はPrP分子の中央部に存在する3アミノ酸の違いにより規定されることを明らかにした。また、PrScの生成に関与する微小環境の条件検討を行ったところ、グリコサミノグリカン(GAG)の構成要素である硫酸多糖がPrPScへの構造転換を促進することを発見した。硫酸多糖は細胞外間マトリックスに多く存在することから、PrPCは細胞膜上に発現することから、プリオン感染動物において細胞外マトリックス中の硫酸多糖がPrPC-PrPSc分子間相互作用に関...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(特定領域研究(C))
    研究期間 : 2001年 -2001年 
    代表者 : 堀内 基広
     
    病原性プリオン蛋白質(PrPSc)と正常型プリオン蛋白質(PrPC)が直接会合することが、PrPScの増殖の第一段階である。そこで、PrPCとPrPScの結合に関与するPrP分子上のドメインを調べることを目的として、各種PrP合成ペプチドがPrPC-PrPSc間の相互作用を阻害するか否かについて検討した。PrPCがPrPSc存在下でPrPSc様のProteinase K(PK)抵抗性分子(PrP-res)に転換する試験管内転換反応で、PrP合成ペプチドaa117-141、aa166-179、aa200-223はPrPCがPrP-resに転換するのを阻害した。これらのPrPペプチドはPrPCと結合することにより、PrPCとPrPScの結合を阻害することが判明した。結合阻害活性を示すPrPペプチドは反応条件下ではβシート構造をとる傾向があることから、PrPペプチドがPrPScのPrPCへの結合ドメインを模倣することでPrPCと結合し、PrPC上のPrPSc結合ドメインを占拠する結果、PrPCとPrPScの結合を阻害する可能性が示唆された。PrPCとPrPScの分子間相互作用を解析する道具として、PrP分子に対するモノクローナル抗体(mAb)パネルを作製した。計34のmAbは認識するエピトープから9群に分類された。グループI〜VIはPrP分子上のリニアエピトープを認識する抗体、グル...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(C))
    研究期間 : 1997年 -1999年 
    代表者 : 堀内 基広, 松井 高峯, 牧野 壮一, 石黒 直隆
     
    羊のスクレイピー、牛の海綿状脳症(BSE)、およびクロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)に代表される伝達性海綿状脳症(プリオン病)の病原体(プリオン)は病原体特異的な核酸を持たないことから、遺伝子型別および抗原型別は病原体型別には応用できない。しかしプリオンは生物学的性状あるいは生化学的性状によりある程度区別可能である。そこで本研究では、日本の羊スクレイピーの病原体に多様性("株")が存在するか否かを明らかにするための一連の実験を行なった。また、プリオンの多様性を規定するPrP以外の宿主の遺伝的要因についても検討を加えた。我が国で過去10年間に日本で発生した羊スクレイピーの11例を選抜し、マウスに接種して伝達性と羊脳内に蓄積したPrP^の蛋白質分解処理抵抗性を調べた。その結果、使用した11例のスクレイピーは生物性状および生化学性状の異なる3群に分類された。つまり日本には複数のスクレイピー病原体が存在することが明らかとなった。本研究のような多数の羊スクレイピーを材料としてその性状を詳細に比較検討した研究はこれまでに英国で報告があるのみで、日本では本研究が初めての例である。本研究で得られた成績は、日本に存在するスクレイピー病原体が動物種を越えて牛や人間に感染する危険性を評価するための重要な知見となる。人ではアポリポプロテインE(ApoE)の特定の遺伝子型が、アルツハイマー病...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(基盤研究(B))
    研究期間 : 1996年 -1998年 
    代表者 : 品川 森一, 堀内 基広, 桑山 秀人, 石黒 直隆
     
    感染性プリオンを試験管内で複製することを最終目標として、試験管内で微量のプリオンと多量の正常プリオン蛋白の接触により正常プリオン蛋白の構造を変えることを目論んだ。以前、動物脳から正常プリオン蛋白を多量に精製することに失敗しているため、今回は組換プリオン蛋白を用いることを計画した。さらにプリオン蛋白の精製の困難さから、組換プリオン蛋白のN端にヒスチジンタグを結合し、キレ-トカラムでアフニティ-精製を導入した。今回われわれの用いた系で、プリオンに見られるように,微量のプリオンを添加することにより組換プリオン蛋白のαヘリックス含量が減少し、βシ-ト含量が増加すること、蛋白分解酵素抵抗性に変化すること、プリオン蛋白の一部に相当する合成ペプチドの添加により阻害されること、さらにこのように変化したプリオン蛋白を次の新たなプリオン蛋白に添加することにより、プリオン添加と同様の構造変化を引き起こすことを見出した。唯、この系では,蛋白分解酵素抵抗性に変わったプリオン蛋白の状態がプリオンと同様の構造を反映しているとはいえない可能性が示唆された。この結果、真のプリオン複製に至らなかったが、プリオン複製のために、プリオン蛋白以外の要因が必要か否かを解析するために適した系として使用できる可能性が示唆された。一方、本研究をサポ-トする周辺領域の研究として,プリオン蛋白検出法の改良,牛プリオン遺伝子の完全...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(試験研究(B), 基盤研究(A))
    研究期間 : 1995年 -1997年 
    代表者 : 品川 森一, 中川 迪夫, 堀内 基広, 久保 正法, 山田 明夫, 古岡 秀文
     
    本研究では、従来から行われているウエスタンブロット(WB)法の試料調整法の改良を行った。その結果、マウスモデルでは、腹腔内接種1週目から脾臓にプリオン蛋白が検出できるようになった。多数検体を検査するためには、より簡便なプリオン検出法が必要であり、マウスモデルを用いてELISA法を開発した。検出感度はウエスタンブロット法のおよそ2倍であった。中枢神経系組織からの試料調整を簡便化し、実際に羊材料に応用可能なことを確かめた上で、この方法の有用性を北海道のと蓄場から分与を受けた羊材料を用いて検証した。また、さらに検出感度を高めるために、ELISAの検出系に光化学反応試薬を導入したところ、およそ20倍ほど検出感度が上昇した。まさらに、コラーゲン中のプリオン検出のための試料調整法も検討し、前処理法としてコラーゲンの粘性を低下させ、大容量から比較的選択的にプリオン蛋白を濃縮することが可能となり、プリオン汚染の検出法に目処がついた。一方、プリオン病は宿主のプリオン蛋白の遺伝子に多型があり、その型によって感受性が異なる。国内の羊プリオン遺伝子型の出現頻度とスクレイピ-との関連を検討した。またプリオンの蓄積は主として中枢神経系であり、少量であるが細網内皮系の組織にも起きる。診断に有用な組織採取部位を決定するためにも、詳細なプリオン蛋白発現の違いを明かにする必要があり、羊体内のプリオン蛋白発現を調...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(奨励研究(A))
    研究期間 : 1995年 -1995年 
    代表者 : 堀内 基広
     
    本研究は伝達性海綿状脳症における神経細胞死と本病関連蛋白質(PrP)の関係を分子レベルで解明することを目的として開始した。これまでにマウス神経芽腫細胞(N2a)、およびラット副腎クロム親和性細胞腫(PC12)に羊PrPC(PrPCは正常型PrPを示す)を過発現させることに成功しているので、これら培養細胞を用いて研究を行った。羊PrPC過発現細胞は内在性PrPCに比べ数十倍羊PrPCを発現している。羊PrPCの過発現自体が細胞に及ぼす影響を調べたが、NGF、cAMPの刺激に対する応答などの生物性状にコントロールとなる正常細胞との間に差は認められなかった。また、羊PrPCの過発現自体が細胞の活性に影響するか否かをLDH遊離試験、Ho33258核染色により調べたが、正常細胞との間に差は認められなかった。クロロキン処理により羊PrPCの蓄積を高めた場合でも顕著な差は認められなかった。神経細胞毒性が報告されているマウスPrPコドン106-129の合成ペプチドに相応する羊PrP合成ペプチドを羊PrPC過発現細胞に添加し本ペプチドの細胞致死活性を調べたが、羊PrP合成ペプチドによる羊PrPC過発現細胞の選択的な細胞死は観察されなかった。現在まで、PrPによる神経細胞毒性が観察されたのはマウスおよびラットの初代神経培養細胞に限られており、株化細胞での例はない。本研究においても神経系株化細胞で...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(一般研究(B))
    研究期間 : 1992年 -1994年 
    代表者 : 品川 森一, 堀内 基広
     
    伝達性海綿状脳症の感染性はPrPの発現が高い中枢神経系に高く、感染性アミロイドの蓄積も起きる。牛PrP遺伝子を導入したL細胞、L-BPrP3は牛PrPを安定に発現している。このため一般の細胞に比べスクレイピ-病原体の複製増殖が起きるのではないかと期待して、細胞への感染実験をマウス及び羊の病原体を用いて行った。しかし対照として用いたL細胞との間に特に差が認められづ、牛PrP遺伝子の影響はなかった。変異遺伝子については感染実験が完了していない為成績から省いた。羊PrP遺伝子型とスクレイピ-感受性の関連を検討する経過で、発症あるいは感染性アミロイドの形成・蓄積にはPrP以外の遺伝子の関与がある可能性が示唆され、我々の用いた線維芽細胞由来のL-BPrP3はなにか未知の因子が欠けているのではないかと推定するに至り、新たに神経系の細胞に羊PrP遺伝子を高度に発現する細胞を樹立した。PrPの解析を行うには、羊或はうしPrPとだけ反応する免疫抗体、マウスPrPとだけ反応する抗体あるいは両者と反応する抗体が必要となり、これら要求を満たす抗体の作製と、高感度にPrPを検出する方法も開発した。また牛PrPのプロモーターの解析を行い、予想された第一エクソンの上流領域以外に、第一エクソンと第二エクソンの間のイントロン領域にもin vitroでプロモーター活性があることを見いだした。羊PrP遺伝子を扱う...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(奨励研究(A))
    研究期間 : 1993年 -1993年 
    代表者 : 堀内 基広
     
    本研究は、猫パルボウイルス亜群に属する猫汎白血球減少症ウイルス(FPLV)、ミンク腸炎ウイルス(MEV)、犬パルボウイルス(CPV)の分子遺伝学的な解析を行い、これら3ウイルスの相互関係、ならびにCPV出現機構の解明を目的とした。ウイルスのVPgeneに存在する宿主域決定領域(60-91map units, Horiuchi et al.,J.Gen.Virol.,in press)をPCR法により増幅し、直接塩基配列決定法(Higuchi and Ochman,Nucleic Acide Res.,1989)により塩基配列を決定した。現在までに、FPLV2株(日本;1974,フランス;分離年不明)、CPV4株(日本;1979,1982,1984,1991)、MEV1株(日本,1980)の計7株の塩基配列を決定した。このうち代表的なもの(FPLV1株,CPV3株,MEV1株)についてはDNA Data Base of Japan(DDBJ)に登録した。株数が少なかったため分子系統樹を書くには至らなかったが、塩基配列より予想されるアミノ酸配列の多重アライメントの結果、宿主域決定領域内に系統発生的にCPV特異的と考えられる5個のアミノ酸を同定した[amino acid(aa)93,aa103,aa305,aa564,aa568]。また、Parrishらが米国で報告したaa300,...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(総合研究(A))
    研究期間 : 1991年 -1993年 
    代表者 : 品川 森一, 石黒 直隆, 平井 克也, 本多 英一, 見上 彪, 堀内 基広, 小沼 操
     
    1.PrP遺伝子に関連する制限酵素切断断片の多様性:日本で飼育されている羊のスクレイピ-の感受性に関わる遺伝的な背景は知られていない。潜伏期及び感受性に関係するPrPの遺伝子に関連した染色体DNAの制限酵素切断断片に多様性(RFLP)が認められ、このRFLPのパターンと潜伏期あるいは感受性の間に関連があることが明らかにされている。日本の羊におけるRFLP型の調査と特定の型とスクレイピ-の関連の有無を検討した。日本各地から集めた羊の組織から染色体DNAを分離し、EcoRIあるいはHindIIIで消化したDNA断片を羊のPrPコード領域をプローベとしてSouthern Hybridizationを行なった。日本の羊はI〜VIの6型に分けられた。またI〜III型は英国で報告された型と一致していた。スクレイピ-の羊18頭の型はI型に8頭と集中しており、一方II型とVI型は、正常な羊128頭で見られる頻度に比べて低く、抵抗性であることが示された。さらにスクレイピ-感受性にかかわる遺伝学的な背景を明らかにするために、地方別のRFLP型の分布を161頭の羊で調べたところ、ある程度の地域差が認められた。2.PrP^検出によるスクレイピ-汚染状況の調査:1988年から1993年までに北海道、東北、関東および中部地方から集めた主にサフォーク種の羊197頭の脳、脾臓およびリンパ節からPrP...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(一般研究(B))
    研究期間 : 1990年 -1991年 
    代表者 : 品川 森一, 堀内 基広, 石黒 直隆
     
    ヒツジ及びウシ脳から得たmRNA画分からcDNAライブラリ-を作成しPrPのcDNAのクロ-ニングを行った。ウシでは2096塩基対から成るクロ-ンが得られたが、ヒツジでは成功しなかった。ヒツジでは染色体DNAからこの遺伝子のコ-ド領域を含む制限酵素断片をクロ-ニングした。さらにPCR法によってヒツジ及びウシの複数の個体から遺伝子をクロ-ニングし、比較解析した。これら遺伝子をそれぞれ発現ベクタ-pcDLーSRa296に組み込み、G418耐性マ-カ-を付与して発現プラスミドを作成した。またウシcDNAを基本として、PrPのN端に欠損を持ったもの及び一部アミノ酸置換が起きるように変異させた遺伝子も作成した。これらをリン酸カルシュウム沈澱法によってマウスL細胞に導入し、G418耐性コロニ-を分離した。何れの遺伝子によっても、それらのPrP^cを核周辺に強く発現している細胞が得られた。しかしヒツジPrP遺伝子を導入した細胞は時間と共に発現する細胞が減少した。ウシ遺伝子を入れた細胞のクロ-ニングにより全ての細胞がウシPrP^cを発現し続けるクロ-ンを樹立した。このクロ-ン化細胞に感染脳乳剤あるいはSAF画分を感染させた細胞には細胞質全体に微細顆粒状の蛍光が認められた。対照の感染L細胞でも同様の所見が得られたが、継代によってそのような細胞が速やかに消失した。変異遺伝子を導入した細胞に付いて...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(一般研究(C))
    研究期間 : 1990年 -1991年 
    代表者 : 石黒 直隆, 堀内 基広
     
    牛T細胞抗原レセプタ-(TCR:α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖)遺伝子を牛末梢血リンパ球および牛胸腺細胞より作成したcDNAライブラリ-より分離し、その構造を解析した。1.牛TCRα鎖は、30個のcDNAクロ-ンの内7クロ-ンが完全長のVーJーC構造を示し、残りは不完全なV領域を有していた。α鎖のC領域は1種類であり、140個のアミノ酸残基からなっていた。2.牛TCRβ鎖は、38個のcDNAクロ-ンの内11クロ-ンが完全長のVーDーJーC構造を示し、DNA塩基配列の相同性から9群のサブファミリ-に分類された。各サブファミリ-は、ヒト由来TCRβ鎖Vファミリ-にそれぞれ高いホモロジ-を示した。牛TCRβ鎖のC領域は2種類存在し、178個のアミノ酸残基からなっていた。3.牛TCRγ鎖は、9クロ-ン分類され、VーJーCの構造を有していたが、完全長の遺伝子は得られなかった。γ鎖C領域は3種類分離されアミノ酸も222個、211個および194個とさまざまであった。4.牛TCRδ鎖は、3クロ-ン分離され、VーDーJーCの構造を有していた。δ鎖のC領域は155個のアミノ酸残基からなっており、マウス、ヒト由来に比べ羊由来C領域に高いホモロジ-を示した。5.牛TCR遺伝子解析中、偶然牛乳酸脱水素酵素遺伝子(LDHーA)を分離した。LDHーA遺伝子は、332個のアミノ酸残基をコ-ドしており、牛TCRα鎖と...
  • 文部科学省:科学研究費補助金(試験研究, 試験研究(B))
    研究期間 : 1988年 -1990年 
    代表者 : 品川 森一, 吉野 智男, 太田 千佳子, 石黒 直隆, 百渓 英一, 堀内 基広
     
    1。抗ヒツジPrP抗体の作成:SAF画分からSDSーPAGEにより精製されたヒツジPrPを免疫して作成したウサギ血清は抗体価も特異性も高いものであった。またウシPrPともヒツジのそれと同様に反応した。2。ヒツジ臓器からのPrP検出用試料の調製:マウス臓器の為に用いていた方法をヒツジ組織のために改良を行なった。3。PrPの検出:スクレイピ-と診断あるいは疑われたヒツジ7頭、と畜場で食肉用に屠殺されたヒツジ30頭、外部の農場から帯広畜産大学に導入され、別の研究目的に供されたもの17頭、および実験感染させたもの10頭、合計64頭の臓器からPrPの検出を行なった。臨床的にも病理組織学的にもスクレイピ-と診断されたヒツジ6頭は何れもPrPが検出された。臨床的にスクレイピ-が疑われ病理組織学的に否定された1頭からは検出できなかった。と畜場から分与を受けた臓器からは全例検出できなかった。一見健康で別の研究目的に供されたものの内、3頭のリンパ節および脾臓からPrPが検出された。これらは同じ牧場で生産されたものであった。実験的に静脈内接種した群のヒツジから経時的に臓器採取を行なった。接種後16ヶ月および18ヶ月に実験に供した各2頭の内それぞれ1頭の各種臓器にPrPが検出された。また14ヶ月後にリンパ節をバイオプシ-した3頭中1頭にPrPが検出された。このヒツジは6ヵ月後にスクレイピ-を発症した...

教育活動情報

主要な担当授業

  • 感染症学特別研究Ⅰ
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 微生物学
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 学士課程
    開講学部 : 医学部
    キーワード : 細菌、ウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、抗酸性菌、感染症、ワクチン、プリオン、寄生虫、原虫、マイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータ、真菌
  • 感染症学特別演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 食品衛生学実習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 学士課程
    開講学部 : 獣医学部
    キーワード : 食肉衛生、乳衛生、食中毒、HACCP
  • アカデミックイングリッシュ
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 基礎動物衛生学
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 学士課程
    開講学部 : 獣医学部
    キーワード : 食品の衛生管理、食品添加物、食中毒、HACCP、安全性評価、食品衛生行政
  • 人獣共通感染症対策専門特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 食品衛生学
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 学士課程
    開講学部 : 獣医学部
    キーワード : 疾病予防、防疫、ワクチン、消毒、動物福祉、家畜衛生行政
  • 感染症学特別研究ⅡA
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 感染症学特別研究ⅡB
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 海外インターンシップA
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 海外インターンシップB
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 獣医科学・感染症学基礎科目 研究機器演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 獣医科学・感染症学基礎科目 獣医衛生学特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 国際感染症学院
  • 獣医科学特別研究
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 専門獣医科学特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • アカデミックイングリッシュ
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 海外実践疫学演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 海外共同研究演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 人獣共通感染症対策専門特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 獣医科学特論演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 獣医科学基礎科目B 研究機器演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • 獣医科学基礎科目B 獣医衛生学特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学研究科
  • アカデミックイングリッシュ
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学院
  • 獣医科学基礎科目 研究機器演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学院
  • 獣医科学基礎科目 獣医衛生学特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学院
  • 専門獣医科学特論
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 博士後期課程
    開講学部 : 獣医学院
  • 研究・臨床セミナー
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 学士課程
    開講学部 : 獣医学部
  • アドバンスト演習
    開講年度 : 2018年
    課程区分 : 学士課程
    開講学部 : 獣医学部

大学運営

学内役職歴

  • 2013年4月1日 - 2014年3月31日 役員補佐
  • 2013年4月1日 - 2016年3月31日 企画・経営室室員
  • 2014年4月1日 - 2015年3月31日 総長補佐
  • 2017年4月1日 - 2019年3月31日 教育研究評議会評議員
  • 2017年4月1日 - 2019年3月31日 獣医学部長
  • 2017年4月1日 - 2019年3月31日 大学院獣医学研究院長
  • 2019年4月1日 - 2021年3月31日 教育研究評議会評議員
  • 2019年4月1日 - 2021年3月31日 獣医学部長
  • 2019年4月1日 - 2021年3月31日 大学院獣医学研究院長


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