Ishimori Koichiro

Faculty of Science　Chemistry　Physical ChemistryProfessor
Research Institute for Electronic Science　Research Center of Mathematics for Social CreativityProfessor
Faculty of EngineeringProfessor
Institute for Integrated Innovations　Institute for Chemical Reaction Design and DiscoveryProfessor
Last Updated :2026/04/15

■Researcher basic information

Degree

  • Ph. D., Kyoto University

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Home Page URL

ORCID ID

J-Global ID

Research Keyword

  • 構造化学
  • 蛋白質工学
  • 分子分光学
  • 生物無機化学
  • 生物物理学
  • Molecular Spectroscopy
  • Protein Engineering
  • Bioinorganic Chemistry
  • Biophysics
  • Structural Chemistry

Research Field

  • Life sciences, Biophysics
  • Nanotechnology/Materials, Basic physical chemistry
  • Nanotechnology/Materials, Biochemistry

Educational Organization

■Career

Career

  • 2006 - Present
    Hokkaido University, Faculty of Science, Professor
  • 2024
    名古屋大学大学院理学研究科, 非常勤講師
  • Apr. 2011 - Mar. 2021
    Osaka University, Institute for Protein Research, 共同研究員
  • 2017
    Kyoto University, Faculty of Science, 非常勤講師
  • 2012
    Yamaguchi University, Faculty of Agriculture, 非常勤講師
  • 2009 - 2011
    Osaka University, Institute of Protein Research, Visiting Fellow
  • 2011
    奈良先端科学技術大学, 非常勤講師
  • 2010
    Tottori University, Faculty of Engineering, 非常勤講師
  • 2008 - 2009
    Nara Women's University, Faculty of Human Life and Environment, 非常勤講師
  • 2005 - 2007
    Kyoto University, Graduate School of Engineering, 非常勤講師
  • 2005 - 2006
    University of Hyogo, of Life Science, Graduate School, 非常勤講師
  • 2005 - 2006
    Institute of Molecular Science, Visiting Professor
  • 2005 - 2006
    Hokkaido University, Graduate School of Science, Professor
  • 2005 - 2006
    Visiting Professor,Institute of Molecular Sceince
  • 2005 - 2006
    Professor,Graduate School of Science, Hokkaido University
  • 2004 - 2005
    Institute of Molecular Science, Visiting Associate Professor
  • 1995 - 2005
    Kyoto University, Graduate School of Engineering, Associate Professor
  • 1989 - 1995
    Kyoto University, Faculty of Engineering, Research Associate
  • 1993 - 1994
    University of Wisconsin-Madison, Visiting Researcher
  • 1987 - 1989
    JSPS, Research Fellow

Educational Background

  • Mar. 1986 - Apr. 1989, Kyoto University, Graduate School of Engineering, Division of Molecular Engineering
  • Apr. 1984 - Mar. 1986, Kyoto University, Graduate School, Division of Engineering, Division of Molecular Engineering, Japan
  • Apr. 1980 - Mar. 1984, Kyoto University, Faculty of Engineering, Department of Hydrocarbon Chemistry, Japan

Committee Memberships

  • 2013 - Present
    Journal of Inorganic Biochemistry, Editorial Board, Society
  • 2012 - Present
    Biophysics and Physicobiology, Editorial Board, Society
  • 2009 - Present
    生体高分子学会, 編集委員, Society
  • 2005 - Present
    日本生化学会, 評議員, Society
  • 2011 - 2013
    日本学術振興会, 科学研究費審査委員, Government
  • 2011 - 2013
    日本生物物理学会, 北海道支部長, Society
  • 2010 - 2012
    日本化学会, 北海道支部幹事, Society
  • 2009 - 2011
    学術振興会, 特別研究員審査委員, Government
  • 2004 - 2007
    日本生物物理学会, 運営委員・副会長, Society

Position History

  • 副学長, 2020年10月1日 - 2026年3月31日
  • 創成研究機構副機構長, 2013年10月1日 - 2014年3月31日
  • 役員補佐, 2013年4月1日 - 2014年3月31日
  • 教育研究評議会評議員, 2014年4月1日 - 2019年3月31日
  • 大学院理学研究院長, 2015年4月1日 - 2019年3月31日
  • 大学院理学研究院副研究院長, 2014年4月1日 - 2015年3月31日
  • 理学部長, 2015年4月1日 - 2019年3月31日
  • 研究戦略室室員, 2013年4月1日 - 2014年3月31日
  • 研究戦略室室員, 2021年4月1日 - 2022年3月31日

■Research activity information

Papers

Other Activities and Achievements

Books and other publications

Lectures, oral presentations, etc.

  • Conserved loop of a phase modifier endows protein condensates with fluidity
    Honoka Kawamukai, Motonori Matsusaki, Takanari Tanimoto, Mai Watabe, Ken Morishima, Shunsuke Tomita, Yoichi Shinkai, Tatsuya Niwa, Taro Mannen, Hiroyuki Kumeta, Hitoki Nanaura, Kotona Kato, Takuya Mabuchi, Yuichiro Aiba, Takeru Uehara, Noriyoshi Isozumi, Yoshika Hara, Shingo Kanemura, Hiroyoshi Matsumura, Kazuma Sugie, Koichiro Ishimori, Takahiro Muraoka, Masaaki Sugiyama, Masaki Okumura, Eiichiro Mori, Takuya Yoshizawa, Tomohide Saio
    04 Jul. 2024, Cold Spring Harbor Laboratory
    04 Jul. 2024 - 04 Jul. 2024, Abstract

    Dipeptide repeats (DPRs) that are gene products from abnormal hexanucleotide repeat expansion inC9orf72trigger amyotrophic lateral sclerosis (ALS) through unknown mechanism. This study highlights, importin Karyopherinβ2 (Kapβ2), which is responsible for nuclear transport and phase modification of RNA-binding proteins (RBPs), as a major DPR target. We demonstrate DPR accumulation in the nucleus via Kapβ2-mediated transport, which results in dose-dependent toxicity observed in nematode and yeast models. In vitro interaction studies exploiting chemical probe arrays and biophysical measurements reveal multivalent DPR binding to Kapβ2, including at the conserved acidic loop. Refractive index and fluorescence imaging coupled with biochemical assays unveiled that binding of excess DPRs to the acidic loop turns a phase modifier Kapβ2 into phase disrupter, resulting more condensed and viscous RBP condensates. Our findings provides molecular insight intoC9orf72-ALS related to age and repeat expansion.
  • ストレスセンサーの会合を制御する多様な相互作用の分子機構(Molecular mechanisms of multiple interactions regulating stress sensor assembly)　　　　　　　　　　　　　　　
    Kawagoe Soichiro, Mabuchi Takuya, Kumeta Hiroyuki, Matsusaki Motonori, Kumashiro Munehiro, Ishimori Koichiro, Saio Tomohide
    生物物理, Oct. 2023, (一社)日本生物物理学会, English
    Oct. 2023 - Oct. 2023
  • Oxidative phase transition of heat shock factor-1
    Soichiro Kawagoe, Motonori Matsusaki, Koichiro Ishimori, Tomohide Saio
    03 Dec. 2021, Cold Spring Harbor Laboratory
    03 Dec. 2021 - 03 Dec. 2021, ABSTRACT

    Heat shock factor 1 (Hsf1) was found as a central upregulator of molecular chaperones in stress adaptation, but it has recently been rediscovered as a major component of persistent nuclear stress bodies (nSBs). When the persistently stressed cells undergo apoptosis, the phase transition of nSBs from fluid to gel-like states is proposed to be an important event in switching the cell fate from survival to death. Nonetheless, how the phase separation and transition of nSBs are driven remain unanswered. In this study, we discovered that Hsf1 formed liquid-liquid phase separation dropletsin vitro, causing the assembly of Hsf1 to drive nSBs formation. Under oxidative conditions, disulfide-bonded and oligomerized Hsf1 formed gel-like and more condensed droplets, confirmed through fluorescence recovery, refractive index imaging, and light scattering. Then, on the basis of our results, we proposed that Hsf1 undergoes oxidative phase transition by sensing redox conditions potentially to drive the cell fate decision by nSBs.
  • 2SJ-02 Interactions in Electron Transfer Complex between Cytochrome c and Cytochrome c Oxidase(2SJ New developments in protein complex research: From molecules to supramolecules and aggregates,The 49th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan)
    Ishimori Koichiro
    Seibutsu Butsuri, 2011, The Biophysical Society of Japan General Incorporated Association, English
    2011 - 2011
  • S14I4 Structural and Functional Characterization of Sensor Proteins Regulated by Heme Binding(Protein-Ligand Interactions)
    Ishimori Koichiro
    Seibutsu Butsuri, 2007, The Biophysical Society of Japan General Incorporated Association, English
    2007 - 2007

Affiliated academic society

  • アメリカ生化学会　　　　　　　　　　　　　　　
  • アメリカ化学会　　　　　　　　　　　　　　　
  • 日本生物物理学会　　　　　　　　　　　　　　　
  • 日本化学会　　　　　　　　　　　　　　　
  • 日本生化学会　　　　　　　　　　　　　　　
  • American Society of Biochemistry and Molecular Biology　　　　　　　　　　　　　　　
  • American Society of Chemistry　　　　　　　　　　　　　　　
  • Biophysical Society of Japan　　　　　　　　　　　　　　　
  • Chemical Society of Japan　　　　　　　　　　　　　　　
  • Biochemical Society of Japan　　　　　　　　　　　　　　　

Research Themes

  • Molecular Mechanism of Signal Transduction System Regulating Biometal Dynamics
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    28 Jun. 2019 - 31 Mar. 2024
    石森 浩一郎
    生命金属科学研究基盤の確立に向けての研究 昨年度に引き続きヘム生合成の鍵酵素アミノレブリン酸合成酵素（ALAS1）の機能発現制御機構と、細胞内鉄代謝制御機構における鉄制御蛋白質（IRP）の機能制御機構について、以下の研究を行う。
    １．細胞内鉄代謝制御機構におけるIRPの機能制御機構解析 細胞内鉄濃度恒常性は、鉄の細胞内への取り込みや鉄を貯蔵する蛋白質を翻訳段階で制御するIRPによって維持されている。本研究課題により、このIRPの翻訳機能を制御するシグナル伝達因子として、ヘムが同定されたが、その結合部位については、アミノ酸変異によって部位が異なることが示唆され、野生型におけるヘム結合部位については確定させることができていなかった。今年度は公募班の岐阜薬科大学の平山が開発したヘム修飾プローブを適用することで、IRPのホモログ蛋白質の一つであるIRP1におけるヘム結合部位が、これまでもそのヘム結合が示唆されていたヘム結合モチーフ部位であると決定することができた。
    ２．鉄応答転写因子Furの新たな機能とその生物学的意義 多くのバクテリアに存在している鉄応答性転写因子Furは、細胞内で利用できる鉄量に応じて鉄取り込みなどの鉄代謝に関する蛋白質の転写制御を行うことで、細胞内鉄恒常性を維持している。しかし、コレラ菌のFurは、ニッケル代謝に関連する蛋白質群をコードしているnikオペロンを制御していることが見出され、その転写機能について、精製蛋白質を用いて検討したところ、ニッケルではなく鉄によって標的DNA配列であるFur boxへの結合が制御されることを見出した。さらに、このnikオペロンを構成する蛋白質の一つであるVC1098はヘムを結合し、その親和性はヘムを活性中心として結合する蛋白質に比べ低く、これまで未同定であったシトクロムc生合成におけるヘムシャペロンである可能性が示唆された。
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area), Hokkaido University, 19H05769
  • Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    28 Jun. 2019 - 31 Mar. 2024
    津本 浩平, 石森 浩一郎, 小椋 康光, 古川 良明, 青野 重利, 城 宜嗣, 高野 順平, 神戸 大朋
    第1期の公募研究が参画したことから、ホームページを更新、毎月のニュースレター発行を継続、充実させた。前年度構築した連携研究・共同研究の積極的な実施体制を浸透させた。
    総括班会議については、COVID-19の感染状況を鑑みてオンライン実施1回、対面とオンラインのハイブリッド実施2回の他、メール会議1回実施した。領域会議は、オンライン実施1回、ハイブリッド実施1回とした。領域会議地方巡業と銘打って、対面とオンラインでのハイブリッド方式での実施を東北大にて準備した（COVID-19感染状況からオンライン実施）。
    また、領域の班会議やシンポジウムとは別に、生命金属科学関連分野の若手研究者を集めて「若手会」を設け、若い世代の人的交流を活発にする試みを開始した（3月にオンライン若手会を実施）。また、オンライン実施等となった、生化学会、化学会、薬学会等各種学術集会においても、合計11回のワークショップ、シンポジウムを共催したほか、生命金属に関連する合同年会（ConMetal2021）を共催し、研究成果を国内外に発信した。前年度の研究成果報告書を冊子としてまとめ、生命金属に関連する研究者に送付、御意見を頂き、領域運営に積極的に活用した。また、生命金属研究各領域の魅力について語り、融合研究を加速させるほか、一般社会にも広くアピールするため、IBmSウエブセミナーを領域内で合計12回にわたって実施した。特に公開可能な内容について順次ホームページで公開している。また、班員が中心となって進めている研究の最先端の内容をまとめた動画の作製に着手、領域内での十分な議論を踏まえ、公開を開始した。
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area), The University of Tokyo, 19H05760
  • Molecular Design and Functional Regulation of Integrated Membrane-bound Protein Using Nono-disc
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    28 Jun. 2019 - 31 Mar. 2021
    Ishimori Koichiro
    We focused on nonodisc-reconstituted halorhodopsin (HR), pumping chloride ion into the cell in response to light, and bacterial cytochrome oxidase (cbb3), promoting four-electron reduction of molecular oxygen in the respiratory chain. Their structures and enzymatic activities were investigated by various kinds of spectroscopies, and the applications of these nanodisc-reconstituted proteins were examined. To facilitate the effective chloride pumping in HR, the interactions between HRs, effects of charges on the membrane, and flexibility of the membrane to tolerate the conformational changes associated with the chloride binding and releasing were found to be essential. We successfully immobilized cbb3 on the electrode and found that immobilized cbb3 can electrochemically mediate the four-electron reduction of molecular oxygen on the electrode. Further experiments are required to improve the efficiency of the reduction of molecular oxygen by using the nanodisc-reconstituted enzyme.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory), Hokkaido University, 19K22193
  • Development and Application of Analysis for Physico-chemical Properties of Proteins in Cellular Multimolecular Crowding Biosystems
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2018 - 31 Mar. 2020
    石森 浩一郎
    令和元年度も平成30年度に引き続き以下の項目について研究を進めたが、新学術領域研究「生命金属科学」の計画研究「生命金属動態を制御するシグナル伝達の分子機構」が採択されたため、年度途中で本研究課題は廃止となった。
    ①細胞場における蛋白質構造の「構造揺らぎ」の部位特異的，定量的評価 平成30年度に引き続き、蛋白質表面にTrpを導入したミオグロビンとシトクロムcの作成を試みた。いずれも安定なTrp導入蛋白質を得るために、そのTrp導入部位について検討したが、実際の変異体を作成する以前に課題が廃止となった。
    ②蛋白質立体構造形成反応 令和元年度はこれまでの研究で明らかになった脱水和に影響を及ぼすアミノ酸残基として、変性状態でヘムが配位するHis26に注目した。このHis26をヘムが配位しないGlnに置換した変異体を作成し、その立体構造過程における脱水和が細胞場環境においては野生型に比べどのように変化するのか追跡を試みたが、予備的な実験が終了する前に課題が廃止となった。
    ③蛋白質間電子伝達複合体形成反応 令和元年度はNMRの緩和解析により、Cyt cにおける構造揺らぎの大きな部位を特定したところ、CcOとの相互作用部位とは離れたHis33に構造揺らぎを反映した化学交換が観測された。このHis33はAsn103と水素結合を形成していることから、HisをPheに置換することでこの水素結合切断したところ、化学交換が消失し、構造揺らぎが抑制されたことが示された。さらに、このような構造揺らぎの抑制はCcOへの電子伝達速度の低下をもたらし、相互作用部位から離れた部位での構造揺らぎがCyt cの電子伝達活性を制御していることが示された。このような構造揺らぎが細胞場類似環境でどのように変化するのか明らかにすることを試みたが、NMRの測定条件を検討するところで本課題が廃止となった。
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area), Hokkaido University, 18H04531
  • Dynamic Structural Characterization of Electron Transfer Complex in Respiratory Chain of Mitochondria and Its Electron Transfer Regulation Mechanism
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2016 - 31 Mar. 2019
    Ishimori koichiro
    One of the essential biological processes, the four-electron reduction of molecular oxygen to water molecules in the mitochondrial respiratory chain, is promoted by the electron transfer from cytochrome c, a typical heme-containing electron transfer protein, to membrane-bound cytochrome c oxidase. In this study, we examined the electron transfer reaction under the physiological conditions and revealed that the interactions between the proteins and lipids in the membrane, structural fluctuations, transient structural changes, of the proteins, the specific protein-protein interactions mediated by a few amino acid residues, and hydrophobic environment in the electron transfer pathways are the crucial factors to effectively promote the electron transfer reaction from cytochrome c to cytochrome c oxidase. These observations and discussion would contribute to the understanding of the molecular regulation mechanism for the inter-protein electron transfer reaction in vivo.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Hokkaido University, 16H04173
  • 複合化活性部位を有する金属酸化酵素における感応性化学種の制御とその設計
    科学研究費助成事業
    01 Apr. 2015 - 31 Mar. 2017
    石森 浩一郎
    平成28年度の研究計画の各項目における研究成果は以下の通りである。


    １．活性化Irrにおける活性部位の構造解析 昨年度に引き続き，NMRによるIrrの構造解析を進めるため、15N、13Cによるラベル化Irrの発現、単離、精製を行い、再現性良く高純度の安定同位体ラベルIrr収量を得ることができる手法を確立することができた。この安定同位体ラベルIrrを用いて、その15N-1H HSQCスペクトルを測定したが、NMRシグナルの分散が十分ではなく、立体構造解析可能なスペクトルを得ることができなかった。これは、これまでのIrr精製時には添加していた2価のマンガンイオンを、その常磁性によるNMR信号への影響を除くため添加しなかったことによって、Irrが安定な立体構造を形成できなかったためと考えられた。そこでこの常磁性の2価マンガンイオンの代わりに、反磁性の2価マグネシウムを加えて精製し、そのNMR測定を行ったが、NMR信号の分散は変化せず、マグネシウムイオンはIrrに結合しないと考えられた。そこで、同様に反磁性の2価亜鉛イオンを結合させることを試みたところ、分散したNMRスペクトルが得られ、その立体構造解析の指針が得られた。


    ２．アミノ酸置換による酸化反応の制御 Irrにおける酸化反応を制御するため、ヘム結合部位に位置するCys29をAlaに置換したところ、その酸化活性は大きく低下し、このCys29はIrrの酸化反応に重要な寄与をすることが明らかとなった。さらに、野生型では二量体を形成するIrrが、この変異により単量体化することが明らかとなった。以上の結果より、このヘム近傍に位置するCys29は酸化反応だけではなく、Irrにおける蛋白質間の会合状態についても大きな役割を果たしていることが新たに示された。
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 15H00909
  • Studies on the proton pump mechanism of the terminal oxidase by time resolved analyses at the hydrogen atom level resolution
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2014 - 31 Mar. 2017
    Yoshikawa Shinya, ISHIMORI Koichiro, TATENO Masaru, SHINZAWA Kyoko, KUBO Minoru, TAMADA Tarou, MISAKI Tomonori
    Cytochrome c oxidase, which is one of the most important enzymes for preserving the Life, reduces molecular oxygen (O2) coupled with proton pumping which creates the proton gradient for driving ATP synthesis by FoF1 ATPase. By using the X-ray free electron laser facility, we have succeeded in (i) determination of the O2 reduction site and (ii) showing that the pumping proton back leak is blocked by O2 binding to a copper ion site included in the O2 reduction site. The O2 reduction site structure has been yet to be determined for the last 50 years. The latter accomplishment together with the former set a mile stone for elucidation of the mechanism of this enzyme at the hydrogen atom level resolution which is a dream of most of Life Scientist.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), University of Hyogo, 26291033
  • Functional and Structural Characterization of Electron Transfer Reactions in Mitochondria Respiratory Chain Utilizing Nanodisc
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2016
    Ishimori Koichiro, Takeshi Uchida, Tomohide Saio
    We reconstituted cytochrome c oxidase (CcO) into a biomembrane model, nanodisc, to characterize its functions in the absence of detergents. The resonance Raman spectra revealed that the reconstitution of CcO into the nanodisc increases the oxygen affinity, leading to efficient reduction of dioxygen to water molecules. To discuss interactions regulating the electron transfer (ET) reactions, we examined the cytochrome c (Cyt c) interaction site on CcO by docking simulation. Unexpectedly, electrostatic interactions do not contribute to the stabilization of the complex, but regulate the binding orientation of Cyt c on CcO. Instead, hydrophobic interactions are the primary factors to stabilize the complex, and the dehydration associated with the formation of the hydrophobic interactions is the key process to facilitate the complex formation. On the other hand, the structural fluctuations are suppressed in the CcO interaction site on Cyt c, which would also characterize the ET reaction.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Hokkaido University, 25288072
  • ヘムをシグナリング分子とする情報伝達システムの構造化学的基盤
    科学研究費助成事業
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2015
    石森 浩一郎
    IRP制御複合体の蛋白質間相互作用解析 IRPと複合体を形成すると考えられるmRNAのIREに対する結合特性，および，ヘムによるIRE結合阻害効果を検討した。その結果，ゲルシフトアッセイでは，その蛋白質としての安定性が低いため，明確な結果が得られなかったIRP2のIRE親和性について，その解離定数はIRP1のおよそ50％程度の0.013 mMであることが示された。さらに，そのヘムによる阻害効果はついては，1当量のヘムの添加で明確な阻害効果が観測され，阻害効果が現れるまでに数当量のヘムが必要なIRP1に比べ，IRP2のほうが低濃度のヘムによって阻害がかかることが示された。このことは細胞内においてIRP2が主な鉄濃度センサーとして機能していることとも対応している。さらに，IRPのIREからの解離に関しては，精製蛋白質を用いた実験では，数十当量のヘムの添加が必要であり，細胞内においてはヘムシャペロンによるIRPへのヘムの輸送および添加と，そのヘム結合によるIRPのIREからの解離が示唆された。一方，細胞内において，鉄高濃度時にIRPと相互作用することでIRPをユビキチン化し，最終的にはその蛋白質分解を促進するFBXL-5蛋白質についても，その大量精製系の確立を試みた。種々のプロモーターの検討の結果，大腸菌としてRosetta (DE3)pLysSを用い，MBPとの融合蛋白質として発現するのが最も収量が多いことを見出し，FBXL-5の大量精製系を確立することに成功した。
    制御系に関連した蛋白質の探索とその機能解析 IRPへヘムを輸送，供与する蛋白質を同定するため，IRPと相互作用する蛋白質の探索を試みた。探索系としては，酵母菌を用いたtwo-hybrid systemと，ヘムを磁気ビーズに結合させた手法について検討を行った。
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 25121701
  • 活性部位の複合化による感応性化学種の制御を利用した酸化酵素の設計と創製
    科学研究費助成事業
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2015
    石森 浩一郎
    活性化Irrの立体構造決定と酸素活性化機構の解明 昨年度に引き続き活性型Irrの構造決定を試み，本年度は特に，そのシグナル伝達分子としてのヘムの結合部位の立体構造について詳細に検討を行った。まず，これまでの研究から，その二段階酸素活性化の第一段階である分子状酸素の過酸化水素の活性化部位については，ラマンスペクトルの解析から，ヘモグロビンなど分子状酸素を安定に結合するタンパク質と異なり，分子状酸素を安定化する水素結合等の相互作用がないことが示され，容易にスーパーオキサイドアニオンが生成しすること，また，ヘム結合部位が疎水的なへムポケットではなく，容易に酸素分子へのプロトン化が起こり，過酸化水素の生成が誘起されることが示された。一方，もう一方のヘム結合部位であるヒスチジンクラスター領域は，昨年度の研究からヘムの分解と非ヘム鉄結合部位が形成されることが示され，さらに活性化Irrの質量分析の結果から，非ヘム鉄結合のアミノ酸としてHis63，His37等を同定することができた。これらの結果から，この非ヘム鉄結合部位は，過酸化水素を水酸ラジカルに活性化することで，自らのアミノ酸の酸化修飾を行うストレスセンサータンパク質PerRと同様な機能を有していることが示された。
    酸化反応酵素としての利用を目指した分子設計 これまでの精製タンパク質を用いた実験から，Irrはタンパク質としての安定性が低く，また，溶存酸素と反応し自己酸化修飾反応が容易に誘起されることが明らかとなった。そこで，Irrを酸化反応に利用する環境として，Irrが安定に存在できる菌体内を検討し，in vivoの条件下で酸化反応を進行させることを試みるため，大腸菌内でIrrを発現する系を構築した。その結果，大腸菌内でIrrの発現を確認し，ヘム添加による酸化反応についてもその活性を検討できる系を構築することができた。
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 25109501
  • Structural Characterization of Subunit-Specific Isotope labelled Membrane Bound Protein
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2015
    ISHIMORI Koichiro, UCHIDA Takeshi
    To discuss the electron transfer mechanism in the respiratory chain in mitochondria, the reconstitution of an isotope labelled key enzyme, cytochrome c oxidase, into the nano-disc, a mimic of membrane in cells, has been examined, which allows us to measure the high resolution NMR spectra of the membrane-bound proteins under the physiological condition. The expression, purification and reconstitution of the bacterial cytochrome c oxidase into the nano-disc were confirmed, leading to the high resolution structural analysis of high molecular weight membrane bound proteins.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research, Hokkaido University, 25650016
  • ヘムをシグナリング分子とする情報伝達システムの構造化学的基盤
    科学研究費助成事業
    01 Apr. 2011 - 31 Mar. 2013
    石森 浩一郎
    Irr，IRPの標的DNA，RNAへの親和性 IrrやIRPの標的DNA，RNAへの親和性は，そのIrr-DNA，およびIRP-RNA複合体の結晶作成の上で重要であるが，これまではゲルシフトアッセイによる解離定数が見積もられただけで，その定量性は十分ではなかった．今年度は蛍光ラベルした標的DNAおよびRNAを用い，そのIrrやIRPへの結合による蛍光の偏光解消度から解離定数をより正確に見積もることを試み，その結果，それぞれ，220 ± 57 nM，6.85 ± 0.26 nMと決定することができた．さらにこの反応溶液中にヘムを添加することにより，蛍光の偏光解消は観測されず，ヘムの添加によって標的DNAやRNAへの結合が完全に阻害されることが確認できた．
    IRPへおけるヘム結合ドメインの決定 完全長のIRPでは，発現に昆虫細胞系を用いるほかなく，その限られた精製蛋白質量と蛋白質の構造不安定性から，結晶形成の条件検討は非常に困難であった．そこで，完全長のIRPの結晶化と並行して，そのヘム結合ドメインのみの結晶構造解析を行うことで，ヘム結合の蛋白質構造に与える影響の解明を試みた．まず，IRP1におけるヘム結合部位の同定を目指して，ヘム結合部位と想定されるヘム制御モチーフ中のCys118とCys300の変異体を作成することで検討を行った．その結果，いずれの変異体においても，ヘム制御蛋白質に特徴的なヘム鉄とその軸配位子Cys間の伸縮振動のラマン線が観測され，ヘムはCys118とCys300に配位することが確認できた．さらに，これらのCys残基はそれぞれドメイン1（1-240）とドメイン2（241-367）にあることから，IRP1におけるヘム結合ドメインは，ドメイン1とドメイン2と決定でき，これらの発現系を大量発現・精製が可能な大腸菌で確立させることにより，その結晶化が期待できる．
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 23121501
  • Analysis of erythroid differentiation by HSP27
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2011 - 2013
    KABE Yasuaki, ISHIMORI Koichiro
    During erythropoiesis, haem synthesis is significantly induced, and abundant haem is utilized as hemoglobin in erythroid cells. However, excessive haem results in cell damages by membrane oxidation. In the present study, we found that haem directly bound to heat shock protein 27 (HSP27) by affinity purification. HSP27 is a small heat shock family protein, which plays an important role for cytoprotection, stress tolerance, cellular differentiation or tissue development. It has been known that the multimerized HSP27 dissociates by several stimuli. Interestingly, exposure of haem directly dissociated the multimerized HSP27 in vivo and in vitro. Knockdown of HSP27 expression resulted in the haem-induced apoptosis and reduced the haemin-induced erythroid differentiation. Furthermore, we also found that HSP27 is essential for erythroid differentiation by using HSP27 knockdown mice.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Keio University, 23570172
  • Analysis of Interactions in High Molecular Weight Protein Complexes by Using Segment Label and Cutting-edge NMR Technologies
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2011 - 2012
    ISHIMORI Koichiro, UCHIDA Takeshi
    To develop new methodologies for structural analysis of biologically important high-molecular-weight protein complexes, applications of the segment label and new NMR techniques such as the transfer cross-saturation (TCS) and residual dipole coupling (RDC) were examined. By using TCS for the final electron transfer complex in the respiratory chain, the complex between cytochrome c and cytochrome c oxidase, we successfully determined the amino acid residues of cytochrome c directly interacting with cytochrome c oxidase.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research, Hokkaido University, 23657070
  • Structural Characterization of Heme-mediated Signaling Mechanism in Protein Regulation System
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2009 - 2011
    ISHIMORI Koichiro, UCHIDA Takeshi
    In this research project, we characterized the heme binding in Iron Response Regulator (Irr) and Iron Regulatory Protein (IRP) and examined their functional significance. We spectroscopically identified the heme binding sites of Irr and, based on the structural information, a molecular mechanism of heme-induced oxidative modification in Irr was proposed. The heme binding sites of IRP were also determined and a new mechanism for the translational regulation by binding of heme was suggested in IRP. These new findings in this research project shed new light on the functional significance of heme in vivo.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Hokkaido University, 21370040
  • 高圧下蛍光分光システムによる蛋白質の構造的揺らぎの定量的解析
    科学研究費助成事業
    2009 - 2010
    石森 浩一郎
    本年度の主な研究成果は以下のとおりである.
    FRETを用いた蛋白質における局所的線圧縮率の算出とその意義の検討 マッコウクジラミオグロビン(Mb)において,そのTrp14をPheに置換し,Eヘリックス末端近くのLys63をCysに置換することで,蛍光団であるAEDANSを63位に結合させたAEDANS修飾変異ミオグロビン,W14F/L63C-AEDNAS Mbを作成することに成功した.このAEDANS修飾変異ミオグロビンにおけるTrp14と,Cys63に結合したAEDANSとの間のFRET効率の圧力依存性について,昨年度に作成した高圧下蛍光分光システムを用いて検討した.この変異Mbは,295nmの励起光で発光する340nm付近のTrp残基に由来する蛍光強度が減少し,逆にAEDANS由来の460nm付近の蛍光を発するようになったことから,Trp14と63位に結合したAEDANSとの間にFRETが起こっていることが示された.これらの蛍光団間のFRET効率は,加圧に従い0.769(50気圧)から0.802(1500気圧)に上昇し,このことはTrp14とCys63位のAEDANS間の距離が加圧により短縮したことを示している.さらにこのFRET効率の定量的解析から,これら2点間の線圧縮率を求めると,3.1×10^<-10>m^2N^<-1>と見積られた.この値は,Mbの等温圧縮率から求めた3×10^<-11>m^2N^<-1>よりも大きく,また,ヘムと蛋白質表面に結合した金属錯体間の電子移動反応の圧力依存性から求めた3×10^<-11>～2×10^<-10>m^2N^<-1>に比べても大きいことから,Trp14とLys63の間の構造揺らぎは大きいと考えられた.このLys63が位置しているEヘリックスはミオグロビンにおける酸素結合部位を形成しており,ヘムに結合した酸素分子と水素結合しているHis64もその隣のアミノ酸残基として位置していることを考慮すると,本研究から得られた結果は,酸素分子が効率よくヘム鉄に結合するために,Eヘリックスの構造的な揺らぎは大きいことを意味している.
    日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 21107501
  • 電子伝達蛋白質複合体の構造化学的解明とその会合・解離の分子機構
    科学研究費助成事業
    2008 - 2009
    石森 浩一郎, 内田 毅
    本年度に得られた研究成果の概要は以下のとおりである.
    1.シトクロム酸化酵素(CcO)の結合により誘起されるシトクロムc(Cytc)における構造変化の解明Cyt cまその電子受容体であるCcOと結合し,CcO-Cytc電子伝達複合体を形成する際には,その立体構造が変化することで電子伝達反応を制御していると考えられる.一般にはこのような高分子量の膜蛋白質であるCcOを含む蛋白質複合体の構造解析は困難であるが,^<15>NラベルしたCyt cを用いて3D-^1H-^<15>N NOESYHSQC(^<15>N-edited NOESY)を用いることで,CcO結合によるCytcの構造変化を検出することに成功した.特に,本研究者等のこれまでの研究から推定されたCyt cのCcOに対する相互作用部位周辺がCcOの結合に伴い有意な構造変化が観測され,Cyt cはCcOと電子伝達複合体を形成する際にはその相互作用部位付近に特異的な構造変化を起こすことが示唆された.今後さらに定量的な構造解析を進めることにより,構造変化による電子伝達の制御機構が明らかになると期待できる.
    2.ドッキングシミュレーションによるCcO側の会合部位の同定 東京大学の北尾准教授の研究グループと共同で,CcO-Cytc電子伝達複合体形成の際のCcO側の相互作用部位について検討を行った.剛体モデルを用いたドッキングシミュレーションの結果,Cyt c側の相互作用部位は本研究者らがNMRを用いて実験的に明らかにした部位と一致し,一方,CcO側も予想通り,負電荷と疎水性のアミノ酸残基による相互作用部位の形成が認められた.さらにここで得られた結果についてMDを適用することにより,さらに詳細にCcO)側の相互作用部位を明らかにすることで,CcO側からもCcO-Cytc間の電子伝達機構を解明できると期待できる.
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 20051002
  • 高圧分光法を用いた蛋白質における構造的揺らぎの解析
    科学研究費助成事業
    2007 - 2007
    石森 浩一郎, 内田 毅, 竹内 浩
    蛋白質構造の構造的揺らぎを定量的に解明するため,人工的な分子内電子伝達蛋白質を設計し,その電子伝達速度の圧力依存性から算出した蛋白質構造における特定の2点問の線圧縮率と,多核多次元NMR法によるdistance geometryや緩和測定から得られる構造的揺らぎの結果を比較した.人工的な分子内電子伝達蛋白質であるルテニウム置換亜鉛ミオグロビン(48,81,83位にそれぞれRu錯体を修飾)の光励起によるZnからRu,あるいはその逆の電子移動過程の反応速度を,常圧から2000気圧程度までの圧力で追跡し,その圧力依存性から,その亜鉛ポルフィリンの亜鉛イオンと蛋白質表面に特異的に修飾したRu錯体間の距離は,Ru錯体の修飾位置(48,81,83位)によって,加圧により0.1から2Å程度,距離が短縮される場合(48位と伸張される場合(81,83位)が観測された.このような異方的な蛋白質構造の短縮・伸張は,緩和測定の結果から得られた局所的な運動性や,distance geometryとは相関がみられず,従来想定されていたように,アミノ酸残基の局部的な運動性や主鎖構造のずれが大きい部位で,必ずしも蛋白質構造の大きな揺らぎが起こっているのではないということを示すことができた.さらに,酸素結合蛋白質であるミオグロビンに比べ,外部からの配位子の結合がなく,そのヘム鉄が6配位構造であるシトクロムcについてもNMRによる緩和時間測定を行ない,主鎖構造の運動性について検討した.その結果,主鎖末端領域やループ領域にやや運動性の高い領域が観測されたものの,全体的にミオグロビンに比べ運動性が制限されている領域が多く,シトクロムcは,ミオグロビンに比べ,蛋白質構造上の揺らぎが小さいことを示唆している.
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 19029002
  • ヘム依存性転写制御複合体の構造と機能
    科学研究費助成事業
    2006 - 2007
    石森 浩一郎, 内田 毅
    ヘム依存性転写因子Irrにおける酸化修飾機構の詳細を検討するため,典型的なペプチド鎖の酸化修飾様式であるカルボニル化を認識する「Oxyblot」法を用いて検討したところ,過酸化水素のスカベンジャー試薬であるカタラーゼを添加した際に酸化修飾が大きく阻害されることを見出した.一方,OHラジカルやO_2-のスカベンジャー試薬の添加ではその阻害効果が見られなかったことから,Irrはヘムと分子状酸素の存在下で過酸化水素を産生し,この過酸化水素によってペプチド鎖の酸化修飾反応が引き起こされることが示された.さらに,以上のような過酸化水素の産生部位を同定するために,ヘムの軸配位子と想定されるCysやHisをそれぞれAlaに置換し,その酸化修飾反応を追跡したところ,His残基が連続しているHis117,His118,His119の置換により酸化修飾反応が大きく阻害されることが示された.しかし,この変異体において産生する過酸化水素の定量を行ったところ,野生型同様の産生能を示し,過酸化水素は酸化修飾には必須であるものの,ペプチド鎖への酸化修飾反応の直接的な活性種ではないことが示唆された.づまり,Irrによって産生された過酸化水素は,再びHis117,His118,His119付近の酸化活性化部位によって,さらに活性な酸化活性種に変換されることを示唆している.以上の結果からIrrにおける酸化修飾反応は,分子状酸素から過酸化水素を経た二段階の活性化反応で進行し,そこで生成した酸化活性種が蛋白質分解の端緒となることが考えられる.
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 18054002
  • 圧力を用いた分子体積プロファイル解析による蛋白質立体構造形成過程での水分子の寄与
    科学研究費助成事業
    2006 - 2007
    石森 浩一郎, 内田 毅
    本年度の研究実績の概要は以下のとおりである。
    1.疎水性アミノ酸残基からの脱水和の分子体積に対する寄与: 疎水性部位からの脱水和による部分分子体積減少の実験的確証を得るため、Cyt cの蛋白質表面に位置する親水性のAsp93を疎水性のLeuに置換し、この変異による立体構造形成に伴う体積変化を追跡した。その結果、この変異により、その立体構造形成による体積の減少量は、約5mLmol^<-1>程度増加した。
    2.高圧下時分割蛍光観測システムの構築疎水性アミノ酸残基からの脱水和の分子体積に対する寄与: 蛋白質の立体構造形成機構を考える上で重要な遷移状態における水分子の挙動を解明するためには、活性化体積ΔV^≠を見積もる必要がある。従来、Cyt cでは、このΔV^≠を見積もるため、種々の圧力下におけるヘムの紫外可視吸収を利用してきたが、この手法では蛋白質部分の構造変化が直接には反映されない。そこで、立体構造形成により、ヘムに近接することでその蛍光強度が減少するTrpの蛍光に注目し、蛋白質部分の変化を直接観察することを試みた。高圧下での立体構造形成反応の追跡については、還元型CytcのCO結合体が非結合体に比べその安定性が低く、レーザー光照射によるヘム鉄からCO分子の解離より、立体構造形成反応が開始可能であることを利用した。その結果、高濃度の塩酸グアニジン存在下のCO結合還元型Cyt cや、COが結合しない酸化型Cyt cでは光照射により、有意な蛍光変化は観測されないが、3.6M塩酸グアニジン存在下のCO結合還元型型Cyt cでは光照射に伴い、蛍光強度の低下が観測された。これはCOの解離によって立体構造形成反応が進行したと考えられ、本装置を用いて種々の圧力下における蛋白質立体構造形成反応をその蛍光変化により、追跡できることが示された。現状では観測される蛍光の強度が弱いが、集光レンズの装着などにより、その強度を上げることで、再現性の良い定量的な測定が期待できる。
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 18031001
  • 圧力を用いた蛋白質立体構造形成の遷移過程における水分子の寄与の解明
    科学研究費助成事業
    2004 - 2005
    石森 浩一郎, 木村 哲哉
    本研究では、水和水の挙動を反映する蛋白質の部分体積に注目し、チトクロムc(Cyt c)の立体構造形成過程の圧力依存性を測定することで、蛋白質立体構造形成における水の挙動について、以下の成果を得た。
    1.塩酸グアニンジン存在下、天然状態と変性状態の平衡状態にあるCyt cについて、その平衡定数の圧力依存性から、部分モル体積の差(ΔV_)をより正確に求めたところ、天然状態の方が約25ml/mol小さいことが示された。Cyt cの立体構造形成におけるこのような負の体積変化は、疎水性部位からの水和水の解離(脱水和)による体積減少が顕著であることを示しており、その原因として疎水性の高い分子団であるヘム周りからの脱水和の寄与が示唆された。このような脱水和は、大きな正のエントロピー変化を伴い、変性状態から天然状態への立体構造形成に伴うペプチド鎖が失う莫大な構造エントロピーを相殺することで、蛋白質の立体構造形成をエネルギー的に有利にしていると考えられた。
    2.初期収縮状態(collapsed state)から天然状態への構造形成のための活性化体積、つまりcollapsed stateから遷移状態までの部分体積の差(ΔV^*_)(-14ml/mol)と1.の結果を比較すると、その体積差は同程度であった。このことは、Cyt cにおいては、その変性状態から天然状態への立体構造形成の全過程で排出される水和水の個数と同程度の個数の水和水が、この遷移状態形成に脱水和することを意味している。つまり、Cyt cにおけるcollapsed stateから天然状態に至る遷移状態の段階で、既に天然状態に近い構造が形成されている可能性を示している。
    日本学術振興会, 特定領域研究, 16041226
  • Structure and Function of Heme-regulated Proteins and Their Molecular Mechanisms
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2003 - 2005
    ISHIMORI Koichiro, TAKAHASHI Satoshi, WAKASUGI Keisuke
    The major results we have obtained in this research project are as follows:
    1. Ligation of Cys to Ferric Heme in Irr and IRP2. Based on the resonance Raman spectra, we successfully identified the Fe-Cys stretching modes in ferric heme-bound Irr and IRP2. These Fe-Cys stretching modes were downshifted, compared with that in conventional Cys-ligated hemoproteins such as P450cam. The downshifted Fe-Cys stretching modes correspond to the lower affinities of these proteins to ferric heme, which is also supported by fluorescence heme titration in Irr. Such weak affinities of these proteins to heme would be one of the characteristics of heme-regulated proteins having "Heme Regulatory Motif'
    2. Redox-dependent Replacement of Axial Ligands. We confirmed the ligation of Cys to ferric heme in Irr and IRP2. By reduction of the heme iron, however, the absorption spectra of heme-bound Irr and IRP2 were drastically changed and the resultant spectra were quite different from ferrous P450cam, which were rather similar to bis-His ligated hemoproteins like cytochrome b_5. The spectral similarity to His-ligated hemoprotein was more evident in the CO adducts of heme-bound Irr and IRP2. The resonance Raman measurements. clearly showed the Fe-His stretching modes in ferrous heme bound lrr and IRP2 and the Fe-C and FeC-O stretching modes in the CO adducts, confirming that axial Cys is replaced with His by reduction of the heme iron. Considering that molecular oxygen can bind to ferrous heme, not ferric heme, the His ligated species in these proteins would be active species to generate reactive oxygen species, which leads to the oxidative modification of the peptide and protein degradation.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 15350101
  • 急速凍結分光法を使った金属酵素およびセンサー蛋白質の反応機構の研究
    科学研究費助成事業
    2003 - 2004
    石森 浩一郎, 高橋 聡, 堀 洋, 若杉 桂輔
    本研究課題で得られた成果は以下のとおりである.
    1.P450酵素における活性阻害剤の結合様式の検討
    ヘム酵素であるP450はバクテリアから高等動物まで広く分布し,種々の薬物の代謝において重要な役割を担っている.したがって,感染症の原因となる真菌類のP450の機能を選択的に阻害できれば抗菌剤として有望な薬剤の開発が期待できる.そこで本研究課題では結核菌とヒトのP450(CYP51)に対する活性阻害剤であるいくつかのアゾール化合物について,その活性阻害様式を共鳴ラマンスペクトルやEPRを用いることで,構造化学的に検討した.その結果,アゾール環の置換基の立体障害とその疎水性度を制御することによって結核菌のP450のみ選択的に結合するアゾール化合物の分子設計が可能であることを示した.
    2.ヘム酸化酵素中間体におけるラジカル位置の制御
    ヘムを含む酸化酵素であるペルオキシターゼ類は多くの動植物に存在し,種々の酸化反応を触媒している.これらの酵素はその反応中間体としてラジカル種を形成するが,そのラジカルの位置については基質の大きさに依存して異なることが知られている.つまり,小さな基質の場合は蛋白質に埋め込まれたポルフィリン環上に,大きな基質の場合は蛋白質表面に露出したアミノ酸上に形成される.われわれは既に小さな基質に対する酸化酵素である西洋わさびペルオキシターゼ(HRP)について,蛋白質表面に芳香族アミノ酸を導入することで、ラジカル位置をポルフィリン環上から導入した芳香族アミノ酸に移動できることを報告してきた.今回,その移動したラジカル種による活性を検証するために,野生型のHRPでは反応性が低い立体障害の大きな基質を用いて検討したところ,蛋白質表面にラジカル種を有する変異体ではその活性が数十倍に増大し,ラジカル位置の制御によってヘム酵素の基質特異性が制御できることが示された.
    日本学術振興会, 萌芽研究, 京都大学, 15657027
  • 金属が関与するセンサーとスイッチのケミカルバイオロジー
    科学研究費助成事業
    2000 - 2004
    西野 武士, 石浜 明, 斎藤 正男, 石森 浩一郎, 岩崎 俊雄, 岡本 研, 新井 賢一, 三浦 謹一郎, 京極 好正
    研究組織は総括班(研究代表者、その他の計画研究代表者2名、評価委員3名および事務担当その他の分担者)および計画研究代表者全体会議である。
    1)平成16年6月19日(午後1時より)に日本医科大学において、計画研究代表者全員および分担研究者,評価委員2名の出席で全体会議を持つた。会議では、それぞれの計画研究代表者の今までの成果と今後の計画を発表し、班員の連係および最終年度のまとめおよび成果公開の具体的計画を立て確認した。
    とくに成果公開を重点におくことそのための3回の公開および関連学会でのシンポジウム開催が確認された。
    2)平成16年度公開シンポジウムを横浜で開催した。生化学会と連動させ実質二日間の国際シンポジウムとなった。公開シンポジウムは生化学会直前にもかかわらず海外からの参加者5名に加え、総数70名を超えた。
    3)また生化学会は初日午前であったが会場はほぼ満席に近く、成果については科学新聞でも大きく取り上げられた。
    4)生物物理学会において代表である西野および斉藤が中心となり金属蛋白質に関するシンポジウムを計画した。
    5)平成17年1月7日(午後1時より7時まで)および8日(午前9時より12時まで)に日本医科大学において、計画研究代表者全員および分担研究者、評価委員1名の出席で全体会議を持った。総括班会議では、それぞれの計画研究の進展状況および各種シンポジウムの報告がなされ、研究の進展状況と問題点が検討された。全体会議では代表者の1年間の成果を発表し、詳しく討論された。さらに最終年度でもあり5年間の研究成果の集約にむけ研究のまとめをと今後の計画の討論を行なった。
    日本学術振興会, 特定領域研究, 日本医科大学, 12147207
  • 構造及び機能単位としてのモジュールを組み合わせた新規蛋白質の分子設計と創製
    科学研究費助成事業
    2000 - 2003
    森島 績, 若杉 桂輔, 高橋 聡, 石森 浩一郎
    1.モジュール間相互作用の再生を目指した方法論の開発
    ヘモグロビンα鎖のヘム結合モジュールをシトクロムb_5の対応する領域に導入したb_5αb_5を作製し、ランダム変異導入後、ヘム親和性を指標に構造力安定化している蛋白質のスクリーニングを行ったところ、ヘム結合モジュールに近接する特定の部位に変異が集中していた。そこで、構造上の歪みがかかっていると考えられるこれら残基に範囲をしぼってランダム変異を導入した変異体集団を作製し、さらに、スクリーニング過程に、崩れた構造の変異蛋白質を蛋白質分解酵素により除去するプロセスを新たに加え方法論の改良を行ったところ、モジュール置換蛋白質の安定性の向上に成功した。
    2.新規機能性蛋白質の創製に成功
    ヒトのトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)と相互作用する蛋白質を探索したところ、解糖系の酵素であるグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GapDH)がTrpRSと結合することが明らかになった。TrpRSと結合するGapDHの結合部位の特定を試みるために、様々なキメラ蛋白質を作製した。ミオグロビン(Mb)のN末端側にGapDHのあるモジュールを融合したキメラ蛋白質は、野生型Mb同様、酸素を可逆的に配位でき、またGAPDH同様にTrpRSと会合する安定な新規蛋白質であることが明らかになった。
    3.酸化ストレス応答性新規グロビン蛋白質の分子機構の解明とその知見に基づく人工蛋白質の設計
    「ニューログロビン(Ngb)」には酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きがあると指摘されている。今回、このNgbが脳神経系においてシグナル伝達系を制御する分子として機能しているという仮説を立て、Ngbが関与する脳神経シグナル伝達系を明らかにすることを目指した。その結果、酸化ストレス下で生成する鉄3価Ngbが細胞内シグナル伝達蛋白質であるGαと特異的に結合すること、他方、通常の酸素正常状態の鉄2価NgbはGαとは相互作用しないことを発見した。また、Ngbは酸化ストレス応答性のセンサー蛋白質として働き、酸化ストレスを受けた時のみGαと結合し、GαのGDP/GTP交換反応抑制蛋白質として機能することにより、神経細胞死を抑制することを明らかにした。さらに、Ngbに関しモジュール置換した種々のキメラ蛋白質を作製し、それらの解析を行うことにより、制御メカニズムを分子レベルで明らかにすることに成功した。
    日本学術振興会, 特別推進研究, 京都大学, 12002008
  • セグメント特異的同位体ラベルP450を用いた電子伝達相互作用部位の解明
    科学研究費助成事業
    2002 - 2002
    石森 浩一郎
    チトクロムP450は炭化水素の特定部位を水酸化する酵素で,その温和な反応条件と反応位置の特異性から酵素化学的だけではなく,実用的,工業的にもその応用が注目されている.この酵素の水酸化反応においての解明するべき点の一つは,分子状酸素の活性化に必要な電子の供給機構であり,この電子伝達機構が解明され,その人工的制御が可能になればこの酵素の応用範囲が大きく広がることが期待される.本研究課題ではこのチトクロムP450における電子伝達機構の解明とその制御を目指して,NMRとペプチド鎖の同位体置換を組み合わせることで,代表的なチトクロムP450であるd-カンファーを基質とする緑膿菌のチトクロムP450(P450cam)と,その電子供与体であるプチダレドキシン(Pd)の電子伝達相互部位の決定,およびその電子伝達過程の制御機構について検討を行った.本研究で得られた主な結果は以下のとおりである.
    1.P450camのNMRスペクトルを詳細に検討し,基質であるd-カンファーやヘム近傍に位置するスレオニン252に由来するNMRシグナルの帰属に成功した.
    2.今回帰属したNMRシグナルを用いて電子供与体であるPdの結合によるP450camのヘム近傍の構造変化を検討し,Pd結合によりヘム面が傾き,ヘム鉄とd-カンファーとの距離が短くなることを見出した.このことは,ヘム鉄上で生成する活性酸素を効率的にd-カンファーに転移させる上で有利であると考えられた.
    3.電子伝達相互作用部位と想定される領域を含むP450camのアミノ酸配列が無細胞系でも合成できることを示し,セグメント特異的同位体ラベルがP450camでも可能であると考えられた.しかし,実際のセグメント特異的同位体ラベルP450camの作製のためには,この配列の収率は低く,更なる反応条件の検討が必要であった.
    日本学術振興会, 萌芽研究, 京都大学, 14658217
  • Development of time-resolved spectroscopic observation systems for the fast dynamics of protein folding
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2000 - 2001
    TAKAHASHI Satoshi, ISHIMORI Koichiro, HARADA Yoshiyuki
    We developed the following original instruments to observe the early dynamics of protein folding. 1) The rapid mixing device that can initiate protein folding within 50 μs. The previous mixing devices has the mixing time of 300〜400 μs. Thus, we achieved to reduce the mixing times to nearly an order shorter. 2) We constructed to the observation system for the CD spectroscopy based on the prism polychrometer and a CCD detector. We resolved several problems associated with the new ideas of spectroscopic observation system, such as the effect of optical retardation. The developed system enabled us to observe the circular dichroism spectra with a high S/N ratio based on the multichannel detection. 3) We tried to combine the developped flow cell system and the spectroscopic observation system ; however, faild to observe reliable data for the repid-mixing cell. We are currently working to reduce the optical retardations of the cells.
    Using the developed flow cell systems, we obtained the following results that were already reported in scientific journals. 1) We observed time-resolved small-angle X-ray scattering profiles for the protein folding dynamics of cytochrome c. The developed cell enabled us to obtain information on the early submillisecond phase of cytohrome c folding that were inaccessible by the conventional devices. We conclude that the protein compaction and the secondary structure formations proceed simultaneously in the folding process of cytochrome c. 2) We observed the helix formation processes of polyglutamic acid using the developed rapid-mixing cell. We demonstrated that a short helix formation precedes the longer helix formation process in the PGA helix formation. This is a new dynamical event observed in the helix formation of polypeptides. 3) The helix-formation and the collapse process of apomyoglobin were observed using the developed rapid mixing systems in the submillisecond time domain. We clarified that the apomyoglobin folding proceed as a stepeise process that is similar to the observation for cytochrome c.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), KYOTO UNIVERSITY, 12558081
  • 金属酵素の不安定中間体を観測するための高速溶液混合実験システムの開発
    科学研究費助成事業
    1999 - 2000
    森島 績, 高橋 聡, 石森 浩一郎
    平成12年度はペルオキシターゼの活性中間体であるCompound Iの生成機構を検討するため,独自に開発した高速混合装置を用いて,西洋ワサビペルオキシターゼ(HRP)と過酸化水素との反応を追跡した。装置としては,本研究者らが開発した高速混合装置を改良することにより,時間分解能50マイクロ秒で可視紫外吸収スペクトルことに成功した。この装置を用いて,上記反応を追跡したところ,HRPの休止状態からCompound Iへのスペクトル変化が,ほぼ等吸収点をとりながら観測できた。このことは休止状態からCompound Iの変化において中間体が存在しないことを意味しているが,過酸化水素の濃度に対するCompound I生成速度の依存性は,速度論的な中間体が存在する明らかに飽和現象を示し,Michaelis-Menten型の解析をすることで,その寿命(半減期)が約10μ秒であることが明らかとなった。さらにこの値をもとに,このような寿命を持つ中間体を仮定したモデルを考え,反応後50マイクロ秒後の中間体の存在割合を求めたところ,約15%と見積もられ,その推定される紫外可視スペクトルは休止状態に類似した鉄3価高スピン型であった。このことは,Compound I生成の中間体として,従来想定されていた3価のヘム鉄にアニオン化した過酸化水素(HOO^-)が結合した鉄3価低スピン型ではなく,中性の過酸化水素(HOOH)が結合した状態であると推定できた。このような中間体を形成する反応機構として,中性の過酸化水素がヘム鉄に結合できるように,ヘム近傍の遠位ヒスチジンと遠位アルギニンが同時に過酸化水素と相互作用しているモデルを新たに提出した。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 京都大学, 11554027
  • 蛋白質構造の「揺らぎ」による電子移動過程の制御
    科学研究費助成事業
    1999 - 2000
    森島 績, 若杉 桂輔, 高橋 聡, 石森 浩一郎
    平成12年度は電子伝達蛋白質のモデル系として,亜鉛置換ミオグロビンとチトクロムb_5の系を構築し,レーザー光の照射による光誘起電子移動反応を検討することで,この電子移動反応における電子移動複合体に構造について考察を行った。従来,この系は電子移動反応を元にした会合定数が,等温適定実験からの会合定数よりはるかに小さいことが予想されており,電子移動を行える会合体は全会合体の一部であると考えられてきた。しかし,この系では,その会合が弱いことから電子移動反応を元にした正確な会合定数は,報告されておらず,実際に一部の会合体しか電子移動を行えないのかどうかは明確ではない。そこで,本研究ではこの系の会合における相互作用が静電的相互作用であることに注目し,イオン強度を下げることにより,Michaelis-Menten型の解析から,その会合定数を8.0x10^4M^<-1>と決定できた。一方,すべての会合体に対する結合定数を求めるために,亜鉛ミオグロビンの蛍光がチトクロムb_5により消光されることに注目した。その結果,会合定数は4.0x10^4M^<-1>と求めることができ,この値は,電子移動反応から求められた値とほぼ同程度であった。以上の結果は,亜鉛置換ミオグロビンとチトクロムb_5における電子移動はほとんどすべての会合体で起こっていることになり,従来の予想を否定する結果となった。さらに,電子移動反応のイオン強度依存性の結果から,この会合体は両蛋白質のヘム面が向かい合った状態であることが示唆され,これはマーカスの式から予想される電子移動反応の距離ともほぼ一致した。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 京都大学, 11480191
  • Protein structure, comparison, prediction, and design
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1995 - 1999
    GO Nobuhiro, YURA Kei, NISHIKAWA Ken, WAKO Hiroshi, YOMO Tetsuya, ISHIMORI Koichiro
    Natural history group (Go, Yura, Wako, Nishikawa, Mitaku, and Umeyama)
    From a classification of the spatial arrangements of the secondary structure elements, Go discovered 'the symmetry rule', whish states that apair of similar protein folds, having no common ancestor, tend to possessan internal symmetry in their fold. Yura found two types of 'modules', a phosphate binding module observed commonly in polymerases and transcription factors, and a substrate-specificity determining module of peroxidases. A newly developed method for detecting similarity in the atomic level revealed a lot of similar ATP binding structures in totally different folds (Go). Wako developed an efficient algorithm of expressing the local environment by a code representation. A new secondary structure prediction method was developed by Nishikawa, who applied the threading method for this purpose. As for the structural prediction for membrane bound proteins, Mitaku improved his method to predict the structure of bacteriorhodopsin correctly. Umeyama established a fully automated algorithm of homology modeling, which is estimated to give a sufficient accuracy.
    Design group (Yomo and Ishimori)
    Yomo found in random mutagenesis experiments on catalase that the thermal stability and activity of the protein is extremely robust against mutations, and that a possibility of the functional optimization by the evolutional engineering technique can enormously enhanced by the elongation of the chain length. The concept of 'module' was applied to produce chimera hemoglobin, which was synthesized by exchanging its modules each other. From such chimera proteins, Ishimori confirmed that the structural unit, module, works not only as the unit of maintaining the protein stability, but also as a unit for realizing the function of hemoglobin.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas, 07280101
  • Protein Engineering and Reactivity Control in Multi-functional Chimeric Metalloproteins
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1996 - 1997
    ISHIMORI Koichiro
    This research project includes the following two subjects.
    (1)Structural Characterization of Natural Chimeric Protein, CooA Protein, and Its Molecular Mechanism
    To investigate structural characterization of CooA protein, which has a myoglobin-like heme binding domain and helix-turn-helix type DNA binding domain, NMR, resonance Raman spectra and ligand binding were utilized. The resonance Raman spectrum for the ferrous CO adduct of CooA protein confirmed the ligation of a histidine residue to the heme iron, while, in the absence of CO, the ligation of an arginine or lysine residue instead of CO were suggested by the NMR spectrum, which is quite unusual in hemoproteins. Although the association rate for the CO rebinding in CooA protein was comparable to that in myoglobin or hemoglobin, it was characterized by its large fraction of the very fast ((2)Protein Engineering for New Chimeric Metalloproteins by Module Substitution.
    Systematic module substitutions for globins in this research project have shown that the previously proposed module is not a minimum structural unit, but can be further divided into two "sub-modules". Particularly, I focused on one of the "sub-modules", "heme binding module", which consists of the iron-liganded histidine and about 20 amino acid residues in the heme proximal side.On the basis of various spectroscopic data including NMR and resonance Raman spectra, it can be concluded that the "heme binding module" would be a primary determinant for the electronic state of the heme and configuration of the liganded histidine in globins.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), KYOTO UNIVERSITY, 08458175
  • Developement and Application of High Pressure Multi-Dimensional NMR Spectroscopy
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1995 - 1997
    MORISHIMA Isao, TAKAHASHI Satoshi, ISHIMORI Koichiro
    The primary results in this research project are as follows :
    (1)Development of High Pressure Multi-Dimensional NMR Spectroscopy. We have tried to measure 2-dimensional proton NMR spectrum of hemoprotein under high pressure (up to 2000 bar). Our preliminary measurement in normal pressure has revealed that the very high sample concentration (more than 10 mM) and 40-60 hours accumulation would be required to obtain the 2D NMR spectrum by using a glass capillary as sample tube. Although the glass capillary needs enough space below the detection coil in the NMR probe, the bottom part of the our probe was used for the temperature control unit, which severely limits the size of the glass capillary. We final concluded that our NMR probe must be modified to use the glass capillary.
    (2)Application of High Pressure Laser Flash Photolysis to Dynamic Properties of Hemoproteins. Since pressure has been considered to perturb thermal fluctuation in protein structure, we examined the effects of the thermal fluctuation on dynamic properties of hemoprotein. One of the dynamic properties we focused on in this research project was the ligand binding in hemoproteins. Systematic combination of mutant myoglobins and kinetic measurement under high pressure has clearly shown that the some of the hydrophobic amino acid residues play a key role in controlling the ligand binding by maintaining the high hydrophobic environments in the heme pocket. Another dynamic property is the electron transfer reaction in hemoproteins. Basied on the measurements of the reaction rates for electron transfer in hemoprotein (myoglobin) under high pressure, we can pointed out that the electron transfer pathway and free energy difference for the reaction would highly depend on the thermal fluctuation in protein structure, and the thermal fluctuation is one of the critical factors of the molecular mechanism for the electron transfer in proteins.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (A), KYOTO UNIVERSITY, 07558215
  • Protein Engineering for New Functional Hemoproteins Based on Module Substitution
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1995 - 1997
    MORISHIMA Isao, TAKAHASHI Satoshi, ISHIMORI Koichiro
    The primary results in this research project are as followa :
    (1)Module Substitution in Globins and Peroxidases. The structural and functional properties of the module-substituted globins and peroxidases have been characterized. Most of the module-substituted proteins exhibited highly destabilized protein structure, probably due to the missing or severe perturbation in the key interactions between the modules. The destabilized protein structure also interfered the formation of the specific dimers or tetramers in globins and enzymatic activity in peroxidases. It can be, therefore, concluded that the module-module interactions are also essential to design new stable and functional proteins as well as the module substitution.
    (2)Identification of New Module Structure in Globins. The amino acid substituteions based on the structural unit of wchic boundaries are located at the middle of the conventional modules have revealed that the module previously proposed can be divided into new and smaller structural units. In this research project, I focused upon one of the newly identified structural units, which includes the iron-liganded histidine and about 20 amino acid residues in the proximal site, "sub-module m6". The substitution of the sub-module m6 in globins drastically affect the electronic state of heme and configuration of the iron-liganded histidine, indicating that the sub-module m6 would be a "heme binding modules" respondible for the heme binding structure.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (A), KYOTO UNIVERSITY, 07409003
  • Protein Engineering for New Functional Hemoproteins Based on Module Substitution
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1994 - 1995
    ISHIMORI Koichiro
    In this research project, the structural and functional properties of the module-substituted globins have extensively been characterized in order to establish a new strategy for the protein design based on the molecular evolution in nature. The module substitutions between the alpha-subunit of human hemoglobin and myoglobin have revealed that the implantation of the module M4 in the hemoglobin alpha-subunit into myoglobin produced a fairly stable dimeric globin protein, MbMbalpha-globin. The formation of dimers in the monomeric myoglobin-based globin strongly suggest that the specific module substitution can be a potent strategy to add the new function to proteins. In the module-substituted globins between the hemoglobin a-subunit and myoglobin except for MbMbalpha-globin, however, their structure were highly destabilized and did anot show any specific subunit association. Some of the module-substituted globins were not expressed in Escherichia coli due to the unstable protein structure. Such destructive effects on the globin structure imply that the intramolecular interactions essential for the stable globin formation are severely perturbed by the module substitution and additional mutations would be required to produce stable functional proteins as well as the module substitution.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for General Scientific Research (C), KYOTO UNIVERSITY, 06808058
  • モジュール置換による新規金属蛋白質の分子設計
    科学研究費助成事業
    1993 - 1993
    石森 浩一郎
    蛋白質の立体構造の詳細な検討から、多くの蛋白質は、モジュールと呼ばれる構造的にほぼ独立した部分の集合体であることが明らかになってきている。しかし、そのモジュール構造と蛋白質全体の構造と機能との相関についての実験的研究はほとんど報告されていない。本研究では金属蛋白質のうち、モジュール構造をとることが知られているミオロビン、ヘモグロビンなどのグロビン蛋白質に注目し、そのモジュール置換により、新規な構造や機能の分子設計、とくに多量形成能と酸素親和性の制御について検討をおこなった。
    天然のミオロビンやヘモグロビンの単離鎖(alpha,beta)は単独では安定な多量体構造をとれないのに対し、2種のヘモグロビンの単離鎖を混合することによりalpha2beta2型の安定な四量体構造が形成される。立体構造とアミノ酸配列からモジュールF4がサブユニット会合に関与していることが示唆されており、実際、我々の従来の研究から天然のbeta鎖のモジュールF4をalpha鎖のものに置換したChimera-betaalphaグロビンは、天然のbeta鎖と特異的に結合し、Chimera-betaalpha2beta2型四量体が生成することを見いだしてきた。今回、これらモジュール置換蛋白質の機能を詳細に検討することにより、Chimera-betaalpha2beta2型四量体が生成する際には、天然での四量体形成時(alpha2beta2)と同様に、酸素親和性が低下することが確認でき、このことはモジュールF4は単に蛋白質を会合させるだけでなく、会合体の機能をも制御することが明かとなった。さらに、単量体でしか存在しないミオグロビンを多量化するため、ヘモグロビンのモジュールF4を含むモジュール置換ミオグロビン2種(Chimera-Mbalpha,Chimera-Mbbeta)を設計し、単離、生成することに成功した。現在、その会合特性と機能変化を検討している。
    日本学術振興会, 奨励研究(A), 京都大学, 05858089
  • Structural and Functional Analysis of Hemoproteins Under High Pressure by Las Photolysis Measurements
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1991 - 1992
    MORISHIMA Isao, ISHIMORI Koichiro, WATANABE Yoshihito
    1. Several site-specific mutants of human myoglobin(Mb) have been prepared in order to examine the influence of highly conserved leucine residues located in the hydrophobic clusters in the heme distal and proximal site on the heme environmental structures and ligand binding properties. Structural and ligand binding characterization of these recombinant proteins were studied by NMR, IR and laser photolysis measurements under different pressures. The leucine 29 mutants exhibited unusual pressure dependence of CO binding rate constant and the resulting pressure dependence of the activation volume implies that pressurization affects the fractional distributions of multi-conformers of Mb so that the fast CO rebinding conformers is increased under pressure.
    2. The effects of pressure on the recombination kinetics of CO binding to the isolated alpha and beta chains of human hemoglobin(Hb) were studied. Pressure dependent activation volume change from negative to positive values in the bimolecular CO association reaction was observed for both isolated chains. This finding was attributed to a change in the rate-determining step from the bond formation to the ligand migration process.
    3. We have also studied pressure effects on the CO association reaction for cytochrome P-450. It was found that the activation volume is quite sensitive to the presence or absence of the substrate, the molecular structure of the substrate.
    4. Finally, we have made a preliminary study on the pressure effect on the intraprotein electron transfer reaction rate.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for General Scientific Research (B), KYOTO UNIVERSITY, 03453009
  • 色素置換ヘム蛋白質における光電子移動反応の動的制御
    科学研究費助成事業
    1990 - 1990
    森島 績, 石森 浩一郎
    本年度は亜鉛置換ミオグロビンにおける光誘起電子移動反応について検討を行なった。電子移動反応はアミノ酸に部位特異的に結合させたルテニウム錯体と亜鉛ポルフィリンの間で行なわせ、その電子移動過程の速度と活性化体積を求めた。ポルフィリン中心から約15オングストロ-ム離れたヒスチジン48にルテニウム錯体を結合させたときの電子移動速度は約5_x10^4s^<ー1>、活性化体積は約1cm^3mol^<ー1>であるのに対し、20オングストロ-ム離れたヒスチジン81にルテニウム錯体を結合させたときの電子移動速度は約50s^<ー1>と非常に遅くなり、一方、活性化体積は約11cm^3mol^<ー1>と非常に大きな値を示した。電子移動過程の速度は電子移動反応の起こりやすさ、つまり、電子移動に適した蛋白質構造への変化のしやすさを示しており、速度の遅い遠距離間の電子移動では電子移動に適した蛋白質構造になりにくいことを示唆している。活性化体積は一般には蛋白質の動的な構造変化を反映しており、本研究の結果は電子移動の距離や位置環境によって電子移動の際の蛋白質の動的構造変化が大きく異なることを示している。特に、電子移動時の活性化体積が正の符号を持つことは、電子移動に伴う蛋白質の構造変化が体積の増加する方向にあることを示しており、電子伝達のメカニズムを考えるうえで非常に興味深い。今回用いたミオグロビンはウマ由来のものであるが同時にアミノ酸置換を施したヒトのミオグロビンについても同様な実験を行なっており、さまざまな電子移動距離、位置環境にあるヒスチジン残基を導入し、その電子移動速度と活性化体積を評価することにより蛋白質内における電子移動反応のメカニズムに対して検討する予定である。
    日本学術振興会, 重点領域研究, 京都大学, 02250222
  • Studies on the Mechanism of Physiological Function of Hemoglobin by Using Artificial Mutants
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    1989 - 1990
    IMAI Kiyohiro, ISHIMORI Koichiro, MIYAZAKI Gentaro, WATANABE Manabu
    Artificial hemoglobin mutants which contained single amino acid substitutions at particular sites were synthesized by site-directed mutagenesis using recombinant DNA and their oxygen binding function, light absorption spectra, proton nuclear magnetic resonance (NMR) spectra and resonance Raman scattering were measured to explore the roles of amino acid residues which are considered to be a key residue for the allosteric properties of hemoglobin.
    Four mutants were synthesized : Hb Y145betaF in which Phe substitutes for Tyr-145beta which is considered to induce a tertiary structure change in the beta subunit ; Hb W37betaF in which Phe substitutes for Trp-37beta which forms a hydrogen bond with Asp-94alpha at the alpha1-beta2 interface ; Hb H92betaV and Hb H92betaD in which the proximal His at 92beta is replaced by Val or Asp. The M13 Phase-E. coli system was used to introduce the mutations into human globin gene and to express the globin gene.
    The changes in oxygen binding functions (oxygen affinity, the Bohr effect, co-operativity, effect of inositol hexaphosphate) of Hb Y145betaF were moderate while those of Hb W37betaF were drastic. The tertiary and quaternary structure data acquired from UV light absorption, NMR, and resonance Raman spectra were nearly consistent with the functional data. It was noted that the important role of Tyr-145beta is that it has a side chain whose size is appropriate to fit to the tyrosine pocket rather than that it forms a hydrogen bond with Asp-94beta. The drastic functional changes in Hb W37betaF may partly be attributed to partial dissociation into alphabeta dimers.
    Hb H92betaV and Hb H92betaD showed drastic functional changes. The replacement of the proximal His by neutral or negatively charged residue caused disapearance of allosteric effects whereas the heme iron of the mutant chains were maintained in a ferrous state, different from the M-type hemoglobins.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for General Scientific Research (C), Osaka University, 01570045
  • 高圧下におけるNMR、分子分光併用測定法の開発とその応用
    科学研究費助成事業
    1987 - 1989
    森島 績, 石森 浩一郎
    本年度は本研究の最終年度として、試作に成功した四ツ窓付きレ-ザ-フォトリシス高圧セルを用いて、ヘム蛋白質の酸素、一酸化炭素の再結合反応速度の圧力依存性に関する詳細な測定実験を行った。本年度は特に、単離したα鎖、β鎖(ヘモグロビン)とCOの結合反応の圧力依存性を詳細に検討した。α、β鎖のCO結合体にレ-ザ-光を照射すると、COが解離した後ヘム鉄に再結合する。このCO再結合反応はナノ秒およびミリ秒の二つの時間領域で観測され、それぞれCOが蛋白質内部再結合する反応、COが蛋白質外部(溶媒)から再結合する反応に対応している。先ず加圧に併ってCOは蛋白質内部で再結合する割合が大きくなった。各素過程の圧力依存性からこれら素反応過程についての活性化体積が見積られた。これより、α、β鎖ともにCOが蛋白質内部に入る際には一旦体積が増加した後、減少することが分かった。この反応に伴う体積変化は、昨年度行ったミオグロビンと酸素の結合反応にも観測されており、ヘモグロビン、ミオグロビンに共通した挙動と考えられる。また、α鎖とβ鎖を比較するとの鎖の方は1モル当り16cm^3だけ体積が増加した後、11cm^3減少する。それに対し、β鎖の方は12cm^3増加後、7cm^3減少とα鎖の方が変化量が大きいことが分かった。このようなα鎖とβ鎖の違いはヘム近傍構造の違いを反映していると考えられた。
    日本学術振興会, 試験研究, 京都大学, 62840013
  • Structural and Functional Characterization of Metalloproteins and Its Molecula Design　　　　　　　　　　　　　　　
    1983
    Competitive research funding

syllabus

  • 自主研究Ⅰ, 2024年, 学士課程, 国際
  • 大学院共通授業科目（一般科目）：複合領域, 2024年, 修士課程, 大学院共通科目
  • 物理化学先端講義, 2024年, 修士課程, 総合化学院
  • 基礎物理化学特論, 2024年, 修士課程, 総合化学院
  • 大学院共通授業科目（一般科目）：自然科学・応用科学, 2024年, 修士課程, 大学院共通科目
  • 化学実験Ⅳ, 2024年, 学士課程, 理学部
  • 化学実験Ｃ, 2024年, 学士課程, 理学部
  • 化学実験Ｄ, 2024年, 学士課程, 理学部
  • 物理化学Ⅲ, 2024年, 学士課程, 理学部