2008年, 日本獣医学会賞　　　　　　　　　　　　　　　
日本国

Genomic characteristics and distinctive genetic polymorphisms of Marek's disease virus strains circulating in Japan.
Shunsuke Yamagami, Jumpei Sato, Yoshinosuke Motai, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Shiro Murata
The Journal of veterinary medical science, 2025年04月03日, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Marek's disease virus (MDV) is an oncogenic herpesvirus that causes malignant lymphomas in chickens (Marek's disease, MD). Although MD is currently well controlled by vaccination, field strains of MDV tend to increase in virulence, and sporadic outbreaks have been reported worldwide, including in Japan. Previously, we determined the whole-genome sequence of a Japanese MDV strain, Kgs-c1, isolated in 2014, and analyzed its genetic characteristics. However, to date, Kgs-c1 is the only MDV strain that has been subjected to whole-genome sequencing, leaving the possibility that the key genetic features of the Japanese strains remain undiscovered. Therefore, we conducted whole-genome sequencing of two MDV strains, Kgs-c2 and Sg-c1, isolated in 2016 and 2019, respectively, and analyzed their genetic characteristics. Consistent with our previous findings, the genomic sequences of the Japanese strains were classified into the Eurasian cluster, suggesting that the Japanese strains are genetically closer to the European and Chinese strains than they are to the US strains. In contrast, the Japanese strains exhibited genetic features different from those of pathogenic European and Chinese strains. Furthermore, polymorphisms in the meq and infected cell protein 4 (ICP4) genes, which are candidates involved in the enhanced virulence of MDV, were observed among the newly isolated strains and Kgs-c1. Thus, three MDV strains isolated in Japan had different genetic features from those in other countries. These findings emphasize the necessity of periodic monitoring of MDV field strains in order to determine shifts in their characteristics and effectively control MD.

Characterization of a lipocalin-like molecule from Dermanyssus gallinae as a potential vaccine antigen.
Fumiya Horio, Hikari Seo, Shwe Yee Win, Jumpei Sato, Yoshinosuke Motai, Shunsuke Yamagami, Takumi Sato, Eiji Ohishi, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Shiro Murata
Veterinary immunology and immunopathology, 283, 110921, 110921, 2025年03月24日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Poultry red mites (PRMs, Dermanyssus gallinae) are hematophagous ectoparasites of chickens that pose a significant threat to the egg-laying industry. The emergence of acaricide-resistant PRMs raises the demand for alternative control approaches such as vaccination. However, several vaccine antigens have failed to suppress the growth of PRM populations in field trials due to difficulties in maintaining antibody levels. In ticks, the molecules exposed to the host, such as lipocalins, can facilitate antibody production, and are therefore considered advantageous as vaccine antigens. Therefore, we focused on a lipocalin-like molecule (Dg-Lipocalin) identified from an RNA-seq analysis reported by Fujisawa et al. (2020) and analyzed its exposure to the host and potential as a vaccine antigen. Western blotting using 500-fold diluted plasma of chickens from PRM-contaminated farms revealed the presence of antibodies against Dg-Lipocalin, suggesting its exposure to the host. To evaluate its potential as a vaccine antigen, PRMs were artificially fed immune plasma with 32,000- to 64,000-fold antibody titers or plasma from PBS-inoculated control chickens, and their mortality was observed for 7 days. In experiment 1, the immune plasma significantly increased PRM mortality compared to the control plasma. However, these effects were not observed in experiment 2, although the total mortality was significantly increased in immune plasma-fed PRMs. Thus, the efficacy of Dg-Lipocalin appears to be limited; however, its exposure to the host may result in sustained antibody titers. Further investigation is required to evaluate its feasibility.

Performance evaluation of an improved RAISING method for clonality analysis of bovine leukemia virus-infected cells: a collaborative study in Japan
Tomohiro OKAGAWA, Naomi NOJIRI, Hazuka YOSHIDA-FURIHATA, Naganori NAO, Misono TOMINAGA, Junko KOHARA, Satoshi GONDAIRA, Hidetoshi HIGUCHI, Yohei TAKEDA, Haruko OGAWA, Shinji YAMADA, Kenji MURAKAMI, Yasunori SUZUKI, Shinji TAKAI, Masaki MAEZAWA, Hisashi INOKUMA, Kaori SHIMIZU, Yasuo INOSHIMA, Tatsufumi USUI, Michihito TAGAWA, Mari YAMAMOTO, Hirohisa MEKATA, Mana ESAKI, Makoto OZAWA, Takahiro MATSUDAIRA, Naoya MAEKAWA, Shiro MURATA, Kazuhiko OHASHI, Masumichi SAITO, Satoru KONNAI
Journal of Veterinary Medical Science, Japanese Society of Veterinary Science, 2025年
研究論文（学術雑誌）

Potential of histamine release factor for the utilization as a universal vaccine antigen against poultry red mites, tropical fowl mites, and northern fowl mites.
Shwe Yee Win, Fumiya Horio, Jumpei Sato, Yoshinosuke Motai, Hikari Seo, Sotaro Fujisawa, Takumi Sato, Eiji Oishi, Lat Lat Htun, Saw Bawm, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Shiro Murata
The Journal of veterinary medical science, 2024年11月20日, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Poultry red mites (PRMs, Dermanyssus gallinae), tropical fowl mites (TFMs, Ornithonyssus bursa), and northern fowl mites (NFMs, Ornithonyssus sylviarum) are hematophagous mites that are distributed worldwide which pose a serious challenge to the poultry industry and negatively impact poultry production and welfare. Vaccines represent a promising approach for controlling avian mites, and the identification of antigens with broad efficacy against multiple avian mite species is advantageous for vaccine control. This study aimed to identify histamine release factor (HRF), which was previously reported as a candidate vaccine antigen against PRMs, from TFMs and NFMs and to analyze its cross-reactivity and acaricidal effects on different avian mite species. The deduced amino acid sequences of the HRFs identified in the TFMs and NFMs were highly homologous to those of the PRMs. We generated recombinant HRF (rHRF) of TFMs, NFMs, and PRMs, and immune plasma against each rHRF was produced by immunization with each antigen. The immune plasma contained antibodies specific to each antigen and showed cross-reactivity with rHRFs from different avian mites. Moreover, PRM nymphs (protonymphs) artificially fed each immune plasma showed higher mortality rates than those fed the control plasma. These results suggest that HRFs can be used as candidate antigens for a universal vaccine with broad efficacy across avian mites.

子牛における地方病性牛伝染性リンパ腫発症は母牛由来の腫瘍細胞が原因か?　　　　　　　　　　　　　　　
廣瀬 海凪, 今内 覚, 岡川 朋弘, 富永 みその, 松原 幸芽, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
北海道獣医師会雑誌, 68, 8, 278, 278, (公社)北海道獣医師会, 2024年08月
日本語

In Vivo Characterization of the Anti-Glutathione S-Transferase Antibody Using an In Vitro Mite Feeding Model
Shwe Yee Win, Hikari Seo, Fumiya Horio, Sotaro Fujisawa, Jumpei Sato, Yoshinosuke Motai, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Lat Lat Htun, Saw Bawm, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Shiro Murata
Vaccines, 12, 2, 148, 148, MDPI AG, 2024年01月30日
研究論文（学術雑誌）, Poultry red mites (Dermanyssus gallinae, PRMs), tropical fowl mites (Ornithonyssus bursa, TFMs), and northern fowl mites (O. sylviarum, NFMs) are blood-feeding pests that debilitate poultry worldwide. Glutathione S-transferase (GST) plays an important role in the detoxification and drug metabolism of mites. However, research on avian mite GSTs as vaccine antigens is still lacking. Therefore, we aimed to evaluate the potential of avian mite GSTs for vaccine development. We identified GST genes from TFMs and NFMs. We prepared recombinant GST (rGST) from TFMs, NFMs, and PRMs, and assessed their protein functions. Moreover, we evaluated the cross-reactivity and acaricidal effect of immune plasma against each rGST on TFMs, NFMs, and PRMs. The deduced amino acid sequences of GSTs from TFMs and NFMs were 80% similar to those of the PRMs. The rGSTs exhibited catalytic activity in conjugating glutathione to the 1-chloro-2,4-dinitrobenzene substrate. Immune plasma against each rGST showed cross-reactivity with rGST from different mite species. Moreover, the survival rate of PRMs fed with immune plasma against the rGST of TFMs and NFMs was significantly lower than that of the control plasma. These results demonstrate the potential application of GST as an antigen for the development of a broad-spectrum vaccine against avian mites.

Characterization of a Very Short Meq Protein Isoform in a Marek's Disease Virus Strain in Japan.
Yoshinosuke Motai, Shiro Murata, Jumpei Sato, Akihito Nishi, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Veterinary sciences, 11, 1, 2024年01月20日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Marek's disease virus (MDV) causes malignant lymphoma (Marek's disease; MD) in chickens. The Meq protein is essential for tumorigenesis since it regulates the expression of host and viral genes. Previously, we reported that the deletion of the short isoform of Meq (S-Meq) decreases the pathogenicity of MDV. Recently, we identified a further short isoform of Meq (very short isoform of Meq, VS-Meq) in chickens with MD in Japan. A 64-amino-acid deletion was confirmed at the C-terminus of VS-Meq. We measured the transcriptional regulation by VS-Meq in three gene promoters to investigate the effect of VS-Meq on protein function. Wild-type VS-Meq decreased the transrepression of the pp38 promoter but did not alter the transactivation activity of the Meq and Bcl-2 promoters. The deletion in VS-Meq did not affect the activity of the pp38 promoter but enhanced the transactivation activities of the Meq and Bcl-2 promoters. Collectively, the deletion of VS-Meq potentially enhanced the activity of the Meq promoter, while other amino acid sequences in wild-type VS-Meq seemed to affect the weak transrepression of the pp38 promoter. Further investigation is required to clarify the effects of these changes on pathogenicity.

Development of a high-affinity anti-bovine PD-1 rabbit-bovine chimeric antibody using an efficient selection and large production system.
Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Shinya Goto, Yamato Sajiki, Otgontuya Ganbaatar, Kei Watari, Hayato Nakamura, Cai-Xia Wang, Taro Tachibana, Yukinari Kato, Yayoi Kameda, Junko Kohara, Nobuhiro Terasaki, Manabu Kubota, Akira Takeda, Hirofumi Takahashi, Yasuhiko Suzuki, Naoya Maekawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Veterinary research, 54, 1, 82, 82, 2023年09月27日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Immune checkpoint molecules PD-1/PD-L1 cause T-cell exhaustion and contribute to disease progression in chronic infections of cattle. We established monoclonal antibodies (mAbs) that specifically inhibit the binding of bovine PD-1/PD-L1; however, conventional anti-PD-1 mAbs are not suitable as therapeutic agents because of their low binding affinity to antigen. In addition, their sensitivity for the detection of bovine PD-1 is low and their use for immunostaining PD-1 is limited. To address these issues, we established two anti-bovine PD-1 rabbit mAbs (1F10F1 and 4F5F2) and its chimeric form using bovine IgG1 (Boch1D10F1), which exhibit high binding affinity. One of the rabbit mAb 1D10F1 binds more strongly to bovine PD-1 compared with a conventional anti-PD-1 mAb (5D2) and exhibits marked inhibitory activity on the PD-1/PD-L1 interaction. In addition, PD-1 expression in bovine T cells could be detected with higher sensitivity by flow cytometry using 1D10F1. Furthermore, we established higher-producing cells of Boch1D10F1 and succeeded in the mass production of Boch1D10F1. Boch1D10F1 exhibited a similar binding affinity to bovine PD-1 and the inhibitory activity on PD-1/PD-L1 binding compared with 1D10F1. The immune activation by Boch1D10F1 was also confirmed by the enhancement of IFN-γ production. Finally, Boch1D10F1 was administered to bovine leukemia virus-infected cows to determine its antiviral effect. In conclusion, the high-affinity anti-PD-1 antibody developed in this study represents a powerful tool for detecting and inhibiting bovine PD-1 and is a candidate for PD-1-targeted immunotherapy in cattle.

Enhanced Systemic Antitumour Immunity by Hypofractionated Radiotherapy and Anti-PD-L1 Therapy in Dogs with Pulmonary Metastatic Oral Malignant Melanoma.
Tatsuya Deguchi, Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Ryo Owaki, Kenji Hosoya, Keitaro Morishita, Motoji Nakamura, Tomohiro Okagawa, Hiroto Takeuchi, Sangho Kim, Ryohei Kinoshita, Yurika Tachibana, Madoka Yokokawa, Satoshi Takagi, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Cancers, 15, 11, 2023年06月01日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Although immune checkpoint inhibitors (ICIs), such as the anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody, have been developed for the treatment of canine malignant melanoma, desirable clinical efficacies have not been achieved. Recent studies in humans have suggested that radiation therapy (RT) combined with ICIs induces robust systemic antitumour immunity in patients with cancer. This study retrospectively examined the therapeutic efficacy of combination therapy (hypofractionated RT and anti-PD-L1 antibody [c4G12]) in dogs with pulmonary metastatic oral malignant melanoma. The intrathoracic clinical benefit rate (CBR)/median overall survival (OS) in the no RT (n = 20, free from the effect of RT), previous RT (n = 9, received RT ≤8 weeks prior to the first c4G12 dose), and concurrent RT (n = 10, c4G12 therapy within ±1 week of the first RT fraction) groups were 10%/185 days, 55.6%/283.5 days (p < 0.05 vs. no RT group), and 20%/129 days (p > 0.05 vs. no RT group), respectively. The adverse events were considered to be tolerable in the combination therapy. Thus, hypofractionated RT before the initiation of c4G12 therapy can be an effective approach for enhancing the therapeutic efficacy of immunotherapy, with acceptable safety profiles. Further prospective clinical studies are required to confirm the findings of this study.

Molecular characterization of immunoinhibitory factors PD-1/PD-L1 in sheep.
Wisa Tiyamanee, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Yutaro Nojima, Otgontuya Ganbaatar, Naoya Maekawa, Rie Hasebe, Yumiko Kagawa, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Veterinary immunology and immunopathology, 261, 110609, 110609, 2023年05月11日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Sheep have been used as a large animal experimental model for studying infectious diseases. However, due to a lack of staining antibodies and reagents, immunological studies on sheep have not progressed. The immunoinhibitory receptor programmed death-1 (PD-1) is expressed on T lymphocytes. The interaction of PD-1 with its ligand PD-ligand 1 (PD-L1) delivers inhibitory signals and impairs proliferation, cytokine production, and cytotoxicity of T cells. We previously reported that the PD-1/PD-L1 pathway was closely associated with T-cell exhaustion and disease progression in bovine chronic infections using anti-bovine PD-L1 monoclonal antibodies (mAbs). Furthermore, we found that blocking antibodies against PD-1 and PD-L1 restore T-cell functions and could be used in immunotherapy of cattle. However, the immunological role of the PD-1/PD-L1 pathway in chronic diseases of sheep remains unknown. In this study, we identified cDNA sequences of ovine PD-1 and PD-L1 and examined the cross-activity of anti-bovine PD-L1 mAbs against ovine PD-L1 as well as the expression of PD-L1 in ovine listeriosis. The amino acid sequences of ovine PD-1 and PD-L1 share a high degree of identity and similarity with homologs from ruminants and other mammalian species. Anti-bovine PD-L1 mAb recognized ovine PD-L1 on lymphocytes in the flow cytometric assay. Furthermore, an immunohistochemical staining confirmed the PD-L1 expression on macrophages in the brain lesions of ovine listeriosis. These findings indicated that our anti-PD-L1 mAb would be useful for analyzing the ovine PD-1/PD-L1 pathway. Further research is needed to determine the immunological role of PD-1/PD-L1 in chronic diseases such as BLV infection through experimental infection of sheep.

Investigation of peripheral blood responses in chickens infested with Dermanyssus gallinae.
Sotaro Fujisawa, Shiro Murata, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Parasitology international, 95, 102754, 102754, 2023年04月22日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Among haematophagous ectoparasites that infest chickens, poultry red mite (Dermanyssus gallinae, PRM) is one of the most serious threats to poultry farms. Mass PRM infestation causes various health problems in chickens, resulting in significant productivity reduction in the poultry industry. Despite the efficiency of acaricides for controlling PRMs, the emergence of acaricide-resistant PRMs represents a challenging setback. Infestation with haematophagous ectoparasites, such as PRMs, induces inflammatory and haemostatic reactions in the host. Therefore, we aimed to explore the gene expression in chicken peripheral blood cells to elucidate host responses against PRM infestation in detail. RNA sequencing of blood-fed PRMs was performed, and the levels of the chicken-derived transcripts obtained from the ingested blood cells were analysed. Genes encoding haemoglobin subunits were found to be significantly more expressed, suggesting that PRM infestation causes anaemia in chickens. Additionally, the mRNA and plasma concentrations of CC chemokine ligand 4 and β2 microglobulin among the immune-related molecules were found to be significantly higher in PRM-infested chickens compared with non-infested animals. These results suggest that PRM infestation induce inflammation in chicken. Further studies are warranted to better understand the influence of PRM infestation on the host physiological states, including immunity.

Analysis of gene expression in poultry red mite, Dermanyssus gallinae, by RNAscope in situ hybridization.
Hikari Seo, Shiro Murata, Osamu Ichii, Takashi Namba, Shwe Yee Win, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
The Journal of veterinary medical science, 85, 5, 532, 535, 2023年03月14日, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The poultry red mite (PRM; Dermanyssus gallinae) is a hematophagous ectoparasite that mainly infests chickens, and its infestation causes significant economic losses to the poultry industry. In this study, we examined the use of RNAscope-based in situ hybridization (ISH) to characterize gene expression in PRM. We analyzed the mRNA expression of Dermanyssus gallinaecathepsin D-1 (Dg-CatD-1) and Dermanyssus gallinae cystatin (Dg-Cys). RNAscope ISH analysis revealed that mRNA expression of Dg-CatD-1 was observed in the digestive tract, and Dg-Cystatin mRNA was expressed in the ovaries in addition to the digestive tract. RNAscope ISH could be applicable for the analysis of gene expression in each tissue of PRM and is an effective method to investigate the characteristics of target genes.

Enhancement of Vaccine-Induced T-Cell Responses by PD-L1 Blockade in Calves.
Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Hayato Nakamura, Otgontuya Ganbaatar, Yamato Sajiki, Kei Watari, Haruka Noda, Mitsuru Honma, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Naoya Maekawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Vaccines, 11, 3, 2023年03月01日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Interactions between programmed death 1 (PD-1) and PD-ligand 1 (PD-L1) cause functional exhaustion of T cells by inducing inhibitory signals, thereby attenuating effector functions of T cells. We have developed an anti-bovine PD-L1 blocking antibody (Ab) and have demonstrated that blockade of the interaction between PD-1 and PD-L1 reactivates T-cell responses in cattle. In the present study, we examined the potential utility of PD-1/PD-L1-targeted immunotherapy in enhancing T-cell responses to vaccination. Calves were inoculated with a hexavalent live-attenuated viral vaccine against bovine respiratory infections in combination with treatment with an anti-PD-L1 Ab. The expression kinetics of PD-1 in T cells and T-cell responses to viral antigens were measured before and after vaccination to evaluate the adjuvant effect of anti-PD-L1 Ab. PD-1 expression was upregulated in vaccinated calves after the administration of a booster vaccination. The activation status of CD4+, CD8+, and γδTCR+ T cells was enhanced by the combination of vaccination and PD-L1 blockade. In addition, IFN-γ responses to viral antigens were increased following combinatorial vaccination with PD-L1 blockade. In conclusion, the blockade of the PD-1/PD-L1 interaction enhances T-cell responses induced by vaccination in cattle, indicating the potential utility of anti-PD-L1 Ab in improving the efficacy of current vaccination programs.

Suppressive modulation of host immune responses by Dermanyssus gallinae infestation.
Sotaro Fujisawa, Shiro Murata, Masayoshi Isezaki, Shwe Yee Win, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Poultry science, 102, 4, 102532, 102532, 2023年01月26日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The poultry red mite (Dermanyssus gallinae, PRM) is a blood-sucking ectoparasite in chickens and is one of the most serious threats to poultry farms. Mass infestation with PRMs causes various health problems in chickens, resulting in significant productivity reduction in the poultry industry. Infestation with hematophagous ectoparasites, such as ticks, induces host inflammatory and hemostatic reactions. On the other hand, several studies have reported that hematophagous ectoparasites secrete various immunosuppressants from their saliva to suppress host immune responses to maintain blood sucking. Here, we examined the expression of cytokines in peripheral blood cells to investigate whether PRM infestation affects immunological states in chickens. In PRM-infested chickens, anti-inflammatory cytokines, IL-10 and TGF-β1, and immune checkpoint molecules, CTLA-4 and PD-1, were highly expressed compared to noninfested chickens. PRM-derived soluble mite extracts (SME) upregulated the gene expression of IL-10 in peripheral blood cells and HD-11 chicken macrophages. In addition, SME suppressed the expression of interferons and inflammatory cytokines in HD-11 chicken macrophages. Moreover, SME induces the polarization of macrophages into anti-inflammatory phenotypes. Collectively, PRM infestation could affect host immune responses, especially suppress the inflammatory responses. Further studies are warranted to fully understand the influence of PRM infestation on host immunity.

Combined Immune Checkpoint Blockade Enhances Antiviral Immunity against Bovine Leukemia Virus.
Hayato Nakamura, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Yamato Sajiki, Kei Watari, Kana Kamitani, Maya Saito, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Journal of virology, 97, 1, e0143022, 2023年01月04日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine leukemia virus (BLV) is a retrovirus that causes enzootic bovine leukosis (EBL) in cattle and is widespread in many countries, including Japan. Recent studies have revealed that the expression of immunoinhibitory molecules, such as programmed death-1 (PD-1) and PD-ligand 1, plays a critical role in immunosuppression and disease progression during BLV infection. In addition, a preliminary study has suggested that another immunoinhibitory molecule, T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (TIM-3), is involved in immunosuppression during BLV infection. Therefore, this study was designed to further elucidate the immunoinhibitory role of immune checkpoint molecules in BLV infection. TIM-3 expression was upregulated on peripheral CD4+ and CD8+ T cells in BLV-infected cattle. Interestingly, in EBL cattle, CD4+ and CD8+ T cells infiltrating lymphomas expressed TIM-3. TIM-3 and PD-1 were upregulated and coexpressed in peripheral CD4+ and CD8+ T cells from BLV-infected cattle. Blockade by anti-bovine TIM-3 monoclonal antibody increased CD69 expression on T cells and gamma interferon (IFN-γ) production from peripheral blood mononuclear cells from BLV-infected cattle. A syncytium formation assay also demonstrated the antiviral effects of TIM-3 blockade against BLV infection. The combined inhibition of TIM-3 and PD-1 pathways significantly enhanced IFN-γ production and antiviral efficacy compared to inhibition alone. In conclusion, the combined blockade of TIM-3 and PD-1 pathways shows strong immune activation and antiviral effects and has potential as a novel therapeutic method for BLV infection. IMPORTANCE Enzootic bovine leukosis caused by bovine leukemia virus (BLV) is an important viral disease in cattle, causing severe economic losses to the cattle industry worldwide. The molecular mechanisms of BLV-host interactions are complex. Previously, it was found that immune checkpoint molecules, such as PD-1, suppress BLV-specific Th1 responses as the disease progresses. To date, most studies have focused only on how PD-1 facilitates escape from host immunity in BLV-infected cattle and the antiviral effects of the PD-1 blockade. In contrast, how T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (TIM-3), another immune checkpoint molecule, regulates anti-BLV immune responses is rarely reported. It is also unclear why PD-1 inhibition alone was insufficient to exert anti-BLV effects in previous clinical studies. In this study, the expression profile of TIM-3 in T cells derived from BLV-infected cattle suggested that TIM-3 upregulation is a cause of immunosuppression in infected cattle. Based on these results, anti-TIM-3 antibody was used to experimentally evaluate its function in influencing immunity against BLV. Results indicated that TIM-3 upregulation induced by BLV infection suppressed T-cell activation and antiviral cytokine production. Some T cells coexpressed PD-1 and TIM-3, indicating that simultaneous inhibition of PD-1 and TIM-3 with their respective antibodies synergistically restored antiviral immunity. This study could open new avenues for treating bovine chronic infections.

Safety and clinical efficacy of an anti-PD-L1 antibody (c4G12) in dogs with advanced malignant tumours.
Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Kenji Hosoya, Sangho Kim, Ryohei Kinoshita, Tatsuya Deguchi, Ryo Owaki, Yurika Tachibana, Madoka Yokokawa, Hiroto Takeuchi, Yumiko Kagawa, Satoshi Takagi, Hiroshi Ohta, Yukinari Kato, Satoshi Yamamoto, Keiichi Yamamoto, Yasuhiko Suzuki, Tomohiro Okagawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
PloS one, 18, 10, e0291727, 2023年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Immune checkpoint inhibitors (ICIs) have been developed for canine tumour treatment, and pilot clinical studies have demonstrated their antitumour efficacy in dogs with oral malignant melanoma (OMM). Although ICIs have been approved for various human malignancies, their clinical benefits in other tumour types remain to be elucidated in dogs. Here, we conducted a clinical study of c4G12, a canine chimeric anti-PD-L1 antibody, to assess its safety and efficacy in dogs with various advanced malignant tumours (n = 12) at the Veterinary Teaching Hospital of Hokkaido University from 2018 to 2023. Dogs with digit or foot pad malignant melanoma (n = 4), osteosarcoma (n = 2), hemangiosarcoma (n = 1), transitional cell carcinoma (n = 1), nasal adenocarcinoma (n = 1), B-cell lymphoma (n = 1), or undifferentiated sarcoma (n = 2) were treated with 2 or 5 mg/kg c4G12 every 2 weeks. Treatment-related adverse events of any grade were observed in eight dogs (66.7%), including elevated aspartate aminotransferase (grade 3) in one dog (8.3%) and thrombocytopenia (grade 4) in another dog (8.3%). Among dogs with target disease at baseline (n = 8), as defined by the response evaluation criteria for solid tumours in dogs (cRECIST), one dog with nasal adenocarcinoma and another with osteosarcoma experienced a partial response (PR), with an objective response rate of 25.0% (2 PR out of 8 dogs; 95% confidence interval: 3.2-65.1%). These results suggest that c4G12 is safe and tolerable and shows antitumor effects in dogs with malignant tumours other than OMM. Further clinical studies are warranted to identify the tumour types that are most likely to benefit from c4G12 treatment.

Characterization of cysteine proteases from poultry red mite, tropical fowl mite, and northern fowl mite to assess the feasibility of developing a broadly efficacious vaccine against multiple mite species.
Shwe Yee Win, Shiro Murata, Sotaro Fujisawa, Hikari Seo, Jumpei Sato, Yoshinosuke Motai, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Lat Lat Htun, Saw Bawm, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
PloS one, 18, 7, e0288565, 2023年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Infestation with poultry red mites (PRM, Dermanyssus gallinae) causes anemia, reduced egg production, and death in serious cases, resulting in significant economic losses to the poultry industry. As a novel strategy for controlling PRMs, vaccine approaches have been focused upon and several candidate vaccine antigens against PRMs have been reported. Tropical (TFM, Ornithonyssus bursa) and northern (NFM, Ornithonyssus sylviarum) fowl mites are also hematophagous and cause poultry industry problems similar to those caused by PRM. Therefore, ideal antigens for anti-PRM vaccines are molecules that cross-react with TFMs and NFMs, producing pesticidal effects similar to those against PRMs. In this study, to investigate the potential feasibility of developing vaccines with broad efficacy across mite species, we identified and characterized cysteine proteases (CPs) of TFMs and NFMs, which were previously reported to be effective vaccine antigens of PRMs. The open reading frames of CPs from TFMs and NFMs had the same sequences, which was 73.0% similar to that of PRMs. Phylogenetic analysis revealed that the CPs of TFMs and NFMs clustered in the same clade as CPs of PRMs. To assess protein functionality, we generated recombinant peptidase domains of CPs (rCP-PDs), revealing all rCP-PDs showed CP-like activities. Importantly, the plasma obtained from chickens immunized with each rCP-PD cross-reacted with rCP-PDs of different mites. Finally, all immune plasma of rCP-PDs reduced the survival rate of PRMs, even when the plasma was collected from chickens immunized with rCP-PDs derived from TFM and NFM. Therefore, CP antigen is a promising, broadly efficacious vaccine candidate against different avian mites.

Potential of ferritin 2 as an antigen for the development of a universal vaccine for avian mites, poultry red mites, tropical fowl mites, and northern fowl mites.
Shwe Yee Win, Shiro Murata, Sotaro Fujisawa, Hikari Seo, Jumpei Sato, Yoshinosuke Motai, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Lat Lat Htun, Saw Bawm, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Frontiers in veterinary science, 10, 1182930, 1182930, 2023年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, INTRODUCTION: Poultry red mites (PRMs, Dermanyssus gallinae), blood-sucking ectoparasites, are a threat to the poultry industry because of reduced production caused by infestation. In addition, tropical fowl mites (TFMs, Ornithonyssus bursa) and northern fowl mites (NFMs, Ornithonyssus sylviarum) are hematophagous, distributed in various regions, genetically and morphologically close to PRMs, and cause similar problems to the poultry industry. Vaccine approaches have been studied for PRM control, and several molecules have been identified in PRMs as candidates for effective vaccine antigens. The development of an anti-PRM vaccine as a universal vaccine with broad efficacy against avian mites could improve the productivity of poultry farms worldwide. Molecules that are highly conserved among avian mites and have critical functions in the physiology and growth of mites could be ideal antigen candidates for the development of universal vaccines. Ferritin 2 (FER2), an iron-binding protein, is critical for the reproduction and survival of PRMs and has been reported as a useful vaccine antigen for the control of PRMs and a candidate for the universal vaccine antigen in some tick species. METHOD AND RESULTS: Herein, we identified and characterized FER2 in TFMs and NFM. Compared with the sequence of PRM, the ferroxidase centers of the heavy chain subunits were conserved in FER2 of TFMs and NFMs. Phylogenetic analysis revealed that FER2 belongs to clusters of secretory ferritins of mites and other arthropods. Recombinant FER2 (rFER2) proteins from PRMs, TFMs, and NFMs exhibited iron-binding abilities. Immunization with each rFER2 induced strong antibody responses in chickens, and each immune plasma cross-reacted with rFER2 from different mites. Moreover, mortality rates of PRMs fed with immune plasma against rFER2 from TFMs or NFMs, in addition to PRMs, were higher than those of control plasma. DISCUSSION: rFER2 from each avian mite exhibited anti-PRM effects. This data suggests that it has the potential to be used as an antigen candidate for a universal vaccine against avian mites. Further studies are needed to access the usefulness of FER2 as a universal vaccine for the control of avian mites.

In vitro evaluation of Lactiplantibacillus plantarum HOKKAIDO strain, effective lactic acid bacteria for calf diarrhea.
Mari Ikehata, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Kentaro Abe, Mitsuru Honma, Toru Kitamura, Naoya Maekawa, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Frontiers in veterinary science, 10, 1145445, 1145445, 2023年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Calf diarrhea adversely affects growth and sometimes results in mortality, leading to severe economic losses to the cattle industry. Antibiotics are useful in the treatment against bacterial diarrhea, but not against viral, protozoan, and antibiotic-resistant bacterial diarrhea. Therefore, there are growing requirements for a novel control method for calf diarrhea. Probiotics have been considered promising candidates for preventive and supportive therapy for calf diarrhea for many years. A recent study has revealed that Lactiplantibacillus plantarum HOKKAIDO strain (Lp-HKD) reduces intestinal pathology and the severity of diarrhea in bovine rotavirus (BRV)-infected calves. Lp-HKD is known to enhance the function of human immune cells and expected to be used as probiotics for humans. Therefore, it is hypothesized that Lp-HKD modulates antiviral immune response in cattle and provide the clinical benefits in BRV-infected calves. However, the detailed mechanism of Lp-HKD-induced immunomodulation remains unknown. Thus, this study aimed to elucidate the immunomodulatory and antiviral effects of Lp-HKD in cattle. Cultivation assay of bovine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) showed that live and heat-killed Lp-HKD stimulates the production of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-10, and interferon-γ (IFN-γ) from PBMCs. Stimulation by heat-killed Lp-HKD yielded stronger cytokine production than stimulation by the live Lp-HKD. Additionally, CD14+ monocytes were identified as major producers of IL-1β, IL-6, and IL-10 under Lp-HKD stimulation; however, IFN-γ was mainly produced from immune cells other than CD14+ monocytes. Depletion of CD14+ monocytes from the PBMCs cultivation strongly decreased cytokine production induced by heat-killed Lp-HKD. The inhibition of toll-like receptor (TLR) 2/4 signaling decreased IL-1β and IL-6 production induced by live Lp-HKD and IL-1β, IL-6, and IFN-γ production induced by heat-killed Lp-HKD. Furthermore, live or heat-killed Lp-HKD also activated T cells and their production of IFN-γ and tumor necrosis factor-α. Then, culture supernatants of bovine PBMCs treated with heat-killed Lp-HKD demonstrated antiviral effects against BRV in vitro. In conclusion, this study demonstrated that Lp-HKD activates the functions of bovine immune cells via TLR2/4 signaling and exerts an antiviral effect against BRV through the induction of antiviral cytokines. Lp-HKD could be useful for the prevention and treatment of calf diarrhea through its immune activating effect.

Molecular characterization of feline immune checkpoint molecules and establishment of PD-L1 immunohistochemistry for feline tumors.
Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Yumie Asano, Takumi Otsuka, Eri Aoki, Hiroto Takeuchi, Yukinari Kato, Mika K Kaneko, Shinji Yamada, Yumiko Kagawa, Maki Nishimura, Satoshi Takagi, Tatsuya Deguchi, Hiroshi Ohta, Takayuki Nakagawa, Yasuhiko Suzuki, Tomohiro Okagawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
PloS one, 18, 1, e0281143, 2023年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Spontaneous tumors are a major cause of death in cats. Treatment of human tumors has progressed dramatically in the past decade, partly due to the success of immunotherapies using immune checkpoint inhibitors, such as anti-programmed death 1 (PD-1) and anti-PD-ligand 1 (PD-L1) antibodies. However, little is known about the PD-1 pathway and its association with tumor disease in cats. This study investigated the applicability of anti-PD-1/PD-L1 therapy in feline tumors. We first determined the complete coding sequence of feline PD-L1 and PD-L2, and found that the deduced amino acid sequences of feline PD-L1/PD-L2 share high sequence identities (66-83%) with orthologs in other mammalian species. We prepared recombinant feline PD-1, PD-L1, and PD-L2 proteins and confirmed receptor-ligand binding between PD-1 and PD-L1/PD-L2 using flow cytometry. Next, we established an anti-feline PD-L1 monoclonal antibody (clone CL1Mab-7) to analyze the expression of PD-L1. Flow cytometry using CL1Mab-7 revealed the cell surface expression of PD-L1 in a feline macrophage (Fcwf-4) and five mammary adenocarcinoma cell lines (FKNp, FMCm, FYMp, FONp, and FONm), and showed that PD-L1 expression was upregulated by interferon-γ stimulation. Finally, immunohistochemistry using CL1Mab-7 also showed PD-L1 expression in feline squamous cell carcinoma (5/5, 100%), mammary adenocarcinoma (4/5, 80%), fibrosarcoma (5/5, 100%), and renal cell carcinoma (2/2, 100%) tissues. Our results strongly encourage further investigations of the PD-1/PD-L1 pathway as a potential therapeutic target for feline tumors.

Characterization of SpsQ from Staphylococcus pseudintermedius as an affinity chromatography ligand for canine therapeutic antibodies.
Hiroto Takeuchi, Chie Nakajima, Satoru Konnai, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Masaru Usui, Yutaka Tamura, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
PloS one, 18, 1, e0281171, 2023年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Coagulase-positive Staphylococci express protein A, which binds to host antibodies, to evade the immune system. Taking advantage of its specific binding to antibodies, protein A from Staphylococcus aureus, which is called SpA, is commonly used as an affinity chromatography ligand for human therapeutic antibodies. However, among four canine IgG subclasses (A, B, C, and D), only IgG-B binds to SpA strongly and establishing an efficient and robust purification scheme for canine therapeutic antibodies whose IgG subclass is A, C, or D remains difficult and depends on finding a suitable substitute to SpA. S. pseudintermedius, a major coagulase-positive Staphylococci found in dogs, expresses spsQ gene which is orthologous to S. aureus spa. We hypothesized that to serve S. pseudintermedius to better adapt to the dog immune system, SpsQ would bind to canine IgGs stronger than SpA, making it a better affinity chromatography ligand for canine therapeutic antibodies. To characterize SpsQ, we first determined the spsQ nucleotide sequence from S. pseudintermedius isolates. Based on the identified sequence, we prepared recombinant proteins containing the immunoglobulin-binding domains of SpA (r-SpA) and SpsQ (r-SpsQ) and determined their binding capacity for each canine IgG subclass. The binding capacity of r-SpsQ for IgG-B was almost as high as that of r-SpA. Interestingly, while both r-SpsQ and r-SpA showed no binding to IgG-C, the binding capacity of r-SpsQ for IgG-A and IgG-D was significantly higher than that of r-SpA. Finally, we performed affinity chromatography using r-SpsQ- or r-SpA-immobilized resin and revealed that the recovery rates of IgG-A and IgG-D using r-SpsQ were significantly higher than those using r-SpA. Our findings indicate that SpsQ has a strong potential to be used as an affinity chromatography ligand for canine therapeutic antibodies of subclass A, B, and D.

Diagnosis and Early Prediction of Lymphoma Using High-Throughput Clonality Analysis of Bovine Leukemia Virus-Infected Cells
Tomohiro Okagawa, Honami Shimakura, Satoru Konnai, Masumichi Saito, Takahiro Matsudaira, Naganori Nao, Shinji Yamada, Kenji Murakami, Naoya Maekawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Microbiology Spectrum, 10, 6, American Society for Microbiology, 2022年10月13日
研究論文（学術雑誌）, Bovine leukemia virus (BLV) infection causes aggressive B-cell lymphoma in cattle and sheep. The virus has spread to farms around the world, causing significant economic damage to the livestock industry.

Prostaglandin E2-Induced Immune Suppression via Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 in Paratuberculosis.
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Kei Watari, Tomohiro Okagawa, Akina Tanaka, Satoko Kawaji, Reiko Nagata, Naoya Maekawa, Yasuhiko Suzuki, Yukinari Kato, Shiro Murata, Yasuyuki Mori, Kazuhiko Ohashi
Infection and immunity, 90, 10, e0021022, 2022年09月14日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Paratuberculosis is a chronic enteritis of ruminants caused by the facultative intracellular pathogen Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. The Th1 response inhibits the proliferation of M. avium subsp. paratuberculosis during the early subclinical stage. However, we have previously shown that immune inhibitory molecules, such as prostaglandin E2 (PGE2), suppress M. avium subsp. paratuberculosis-specific Th1 responses as the disease progresses. To date, the mechanism underlying immunosuppression during M. avium subsp. paratuberculosis infection has not been elucidated. Therefore, in the present study, we investigated the function of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) expressed by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from cattle with paratuberculosis because CTLA-4 expression is known to be elevated in T cells under an M. avium subsp. paratuberculosis experimental infection. M. avium subsp. paratuberculosis antigen induced CTLA-4 expression in T cells from cattle experimentally infected with M. avium subsp. paratuberculosis. Interestingly, both PGE2 and an E prostanoid 4 agonist also induced CTLA-4 expression in T cells. In addition, a functional assay with a bovine CTLA-4-immunogobulin fusion protein (CTLA-4-Ig) indicated that CTLA-4 inhibited gamma interferon (IFN-γ) production in M. avium subsp. paratuberculosis-stimulated PBMCs, while blockade by anti-bovine CTLA-4 monoclonal antibody increased the secretion of IFN-γ and tumor necrosis factor alpha production in these PBMCs. These preliminary findings show that PGE2 has immunosuppressive effects via CTLA-4 to M. avium subsp. paratuberculosis. Therefore, it is necessary to clarify in the future whether CTLA-4-mediated immunosuppression facilitates disease progression of paratuberculosis in cattle.

乳酸菌Lactobacillus plantarum HOKKAIDO株による免疫制御機序の解明　　　　　　　　　　　　　　　
池端 麻里, 今内 覚, 岡川 朋弘, 阿部 健太郎, 本間 満, 北村 亨, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [DI1A, 01], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

ネコ腫瘍組織におけるprogrammed death ligand 1(PD-L1)の発現解析　　　　　　　　　　　　　　　
青木 絵理, 今内 覚, 前川 直也, 岡川 朋弘, 竹内 寛人, 佐藤 純平, 浅野 裕美恵, 大塚 拓海, 賀川 由美子, 加藤 幸成, 高木 哲, 鈴木 定彦, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [DI1A, 04], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

鼻疽の診断抗原の探索　　　　　　　　　　　　　　　
市川 世識, 飯沼 由希帆, 岡川 朋弘, 前川 直也, 村田 史郎, 今内 覚, 木下 優太, 丹羽 秀和, 青島 圭佑, 小林 篤史, 大橋 和彦, 木村 享史
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [DI1A, 09], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

広範な有効性を示すワクチン開発のための鳥類寄生ダニ由来システインプロテアーゼの特性解析(Characterization of cysteine proteases from avian mites to develop a vaccine with broad efficacy)　　　　　　　　　　　　　　　
Win Shwe Yee, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 瀬尾 光里, 佐藤 純平, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 岡川 朋弘, 前川 直也, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [E3P, 02], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
英語

ワクモ(Dermanyssus gallinae)由来シスタチン様分子の抗ワクモワクチン抗原としての評価　　　　　　　　　　　　　　　
藤澤 宗太郎, 村田 史郎, 伊勢崎 政美, 有泉 拓馬, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 前川 直也, 岡川 朋弘, 市居 修, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [E3P, 01], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

ワクモ由来の2種類のアスパラギン酸ペプチダーゼの性状解析　　　　　　　　　　　　　　　
瀬尾 光里, 村田 史郎, Shwe Yee Win, 藤澤 宗太郎, 北條 巧, 伊勢崎 政美, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 市居 修, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [E3P, 03], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

乳酸菌Lactobacillus plantarum HOKKAIDO株による免疫制御機序の解明　　　　　　　　　　　　　　　
池端 麻里, 今内 覚, 岡川 朋弘, 阿部 健太郎, 本間 満, 北村 亨, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [DI1A, 01], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

ネコ腫瘍組織におけるprogrammed death ligand 1(PD-L1)の発現解析　　　　　　　　　　　　　　　
青木 絵理, 今内 覚, 前川 直也, 岡川 朋弘, 竹内 寛人, 佐藤 純平, 浅野 裕美恵, 大塚 拓海, 賀川 由美子, 加藤 幸成, 高木 哲, 鈴木 定彦, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [DI1A, 04], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

ワクモ(Dermanyssus gallinae)由来シスタチン様分子の抗ワクモワクチン抗原としての評価　　　　　　　　　　　　　　　
藤澤 宗太郎, 村田 史郎, 伊勢崎 政美, 有泉 拓馬, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 前川 直也, 岡川 朋弘, 市居 修, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [E3P, 01], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

広範な有効性を示すワクチン開発のための鳥類寄生ダニ由来システインプロテアーゼの特性解析(Characterization of cysteine proteases from avian mites to develop a vaccine with broad efficacy)　　　　　　　　　　　　　　　
Win Shwe Yee, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 瀬尾 光里, 佐藤 純平, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 岡川 朋弘, 前川 直也, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [E3P, 02], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
英語

ワクモ由来の2種類のアスパラギン酸ペプチダーゼの性状解析　　　　　　　　　　　　　　　
瀬尾 光里, 村田 史郎, Shwe Yee Win, 藤澤 宗太郎, 北條 巧, 伊勢崎 政美, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 市居 修, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [E3P, 03], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

鼻疽の診断抗原の探索　　　　　　　　　　　　　　　
市川 世識, 飯沼 由希帆, 岡川 朋弘, 前川 直也, 村田 史郎, 今内 覚, 木下 優太, 丹羽 秀和, 青島 圭佑, 小林 篤史, 大橋 和彦, 木村 享史
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 165回, [DI1A, 09], (公社)日本獣医学会, 2022年09月
日本語

Suppressive effects of Ixodes persulcatus sialostatin L2 against Borrelia miyamotoi-stimulated immunity.
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Masayoshi Isezaki, Shinji Yamada, Takuya Ito, Kozue Sato, Hiroki Kawabata, Carlos Logullo, Itabajara da Silva Vaz Jr, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Ticks and tick-borne diseases, 13, 4, 101963, 101963, 2022年07月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Borrelia miyamotoi infection is an emerging tick-borne disease that causes hard tick-borne relapsing fever. B. miyamotoi is transmitted through the bite of ticks, including Ixodes persulcatus. Although accumulating evidence suggests that tick salivary proteins enhance the infectivity of other tick-borne pathogens, the association of B. miyamotoi with tick-derived proteins remains unknown. In this study, the effect of I. persulcatus sialostatin L2 (Ip-sL2), a tick-derived cystatin, on specific immunity to B. miyamotoi was preliminarily investigated in vitro. Mice were immunized with heat-killed B. miyamotoi and in vitro analyses of the splenocytes of the immunized mice indicated that the expression levels of the activation markers of CD11c+ and CD3+ cells were significantly upregulated by B. miyamotoi stimulation. Spleen cells from B. miyamotoi-immunized mice were used to determine whether Ip-sL2 regulates murine immune responses against B. miyamotoi. Treatment with Ip-sL2 in vitro inhibited the activation of CD11c+ and CD3+ cells as well as inflammatory cytokine production by cultured splenocytes. These findings show that Ip-sL2 has modulatory effects on murine immune responses to B. miyamotoi. Therefore, it is necessary to clarify in the future whether Ip-sL2 is involved in the enhanced infectivity of B. miyamotoi.

Exploration of serum biomarkers in dogs with malignant melanoma receiving anti-PD-L1 therapy and potential of COX-2 inhibition for combination therapy.
Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Yumie Asano, Yamato Sajiki, Tatsuya Deguchi, Tomohiro Okagawa, Kei Watari, Hiroto Takeuchi, Satoshi Takagi, Kenji Hosoya, Sangho Kim, Hiroshi Ohta, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Scientific reports, 12, 1, 9265, 9265, 2022年06月03日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Immune checkpoint inhibitors (ICIs) such as anti-PD-L1 antibodies are widely used to treat human cancers, and growing evidence suggests that ICIs are promising treatments for canine malignancies. However, only some canine oral malignant melanoma (OMM) cases respond to ICIs. To explore biomarkers predictive of survival in dogs with pulmonary metastatic OMM receiving the anti-PD-L1 antibody c4G12 (n = 27), serum concentrations of prostaglandin E2 (PGE2), cytokines, chemokines, and growth factors were measured prior to treatment initiation. Among 12 factors tested, PGE2, interleukin (IL)-12p40, IL-8, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), and stem cell factor (SCF) were higher in OMM dogs compared to healthy dogs (n = 8). Further, lower baseline serum PGE2, MCP-1, and vascular endothelial growth factor (VEGF)-A concentrations as well as higher IL-2, IL-12, and SCF concentrations predicted prolonged overall survival. These observations suggest that PGE2 confers resistance against anti-PD-L1 therapy through immunosuppression and thus is a candidate target for combination therapy. Indeed, PGE2 suppressed IL-2 and interferon (IFN)-γ production by stimulated canine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), while inhibition of PGE2 biosynthesis using the COX-2 inhibitor meloxicam in combination with c4G12 enhanced Th1 cytokine production by PBMCs. Thus, serum PGE2 may be predictive of c4G12 treatment response, and concomitant use of COX-2 inhibitors may enhance ICI antitumor efficacy.

Estradiol-induced immune suppression via prostaglandin E2 during parturition in bovine leukemia virus-infected cattle
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Shinya Goto, Junko Kohara, Atsushi Nitanai, Hirofumi Takahashi, Kentaro Kubota, Hiroshi Takeda, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
PLOS ONE, 17, 3, e0263660, e0263660, Public Library of Science (PLoS), 2022年03月09日
研究論文（学術雑誌）, Immune suppression during pregnancy and parturition is considered a risk factor that is related to the progression of bovine chronic diseases, such as bovine leukosis, which is caused by bovine leukemia virus (BLV). Our previous studies have demonstrated that prostaglandin E₂ (PGE₂) suppresses BLV-specific Th1 responses and contributes to the disease progression during BLV infection. Although PGE₂ reportedly plays important roles in the induction of parturition, PGE₂ involvement in immune suppression during parturition is unknown. To investigate its involvement, we analyzed PGE₂ kinetics and Th1 responses in BLV-infected pregnant cattle. PGE₂ concentrations in sera were increased, whereas IFN-γ responses were decreased before delivery. PGE₂ is known to suppress Th1 immune responses in cattle. Thus, these data suggest that PGE₂ upregulation inhibits Th1 responses during parturition. We also found that estradiol was important for PGE₂ induction in pregnant cattle. In vitro analyses indicated that estradiol suppressed IFN-γ production, at least in part, via PGE₂/EP4 signaling. In vivo analyses showed that estradiol administration significantly influenced the induction of PGE₂ production and impaired Th1 responses. Our data suggest that estradiol-induced PGE₂ is involved in the suppression of Th1 responses during pregnancy and parturition in cattle, which could contribute to the progression of BLV infection.

In vitro evaluation of a cysteine protease from poultry red mites, Demanyssus gallinae, as a vaccine antigen for chickens
Takuma Ariizumi, Shiro Murata, Sotaro Fujisawa, Masayoshi Isezaki, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Osamu Ichii, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Poultry Science, 101, 3, 101638, 101638, Elsevier BV, 2022年03月
研究論文（学術雑誌）

Effect of Insertion and Deletion in the Meq Protein Encoded by Highly Oncogenic Marek’s Disease Virus on Transactivation Activity and Virulence
Jumpei Sato, Shiro Murata, Zhiyuan Yang, Benedikt B. Kaufer, Sotaro Fujisawa, Hikari Seo, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Nikolaus Osterrieder, Mark S. Parcells, Kazuhiko Ohashi
Viruses, 14, 2, 382, 382, MDPI AG, 2022年02月14日
研究論文（学術雑誌）, Marek’s disease virus (MDV) causes malignant lymphoma in chickens (Marek’s disease, MD). Although MD is currently controlled by vaccination, MDV strains have continuously increased in virulence over the recent decades. Polymorphisms in Meq, an MDV-encoded oncoprotein that serves as a transcription factor, have been associated with the enhanced virulence of the virus. In addition, insertions and deletions in Meq have been observed in MDV strains of higher virulence, but their contribution to said virulence remains elusive. In this study, we investigated the contribution of an insertion (L-Meq) and a deletion in the Meq gene (S-Meq) to its functions and MDV pathogenicity. Reporter assays revealed that both insertion and deletion enhanced the transactivation potential of Meq. Additionally, we generated RB-1B-based recombinant MDVs (rMDVs) encoding each Meq isoform and analyzed their pathogenic potential. rMDV encoding L-Meq indueced the highest mortality and tumor incidence in infected animals, whereas the rMDV encoding S-Meq exhibited the lowest pathogenicity. Thus, insertion enhanced the transactivation activity of Meq and MDV pathogenicity, whereas deletion reduced pathogenicity despite having increased transactivation activity. These data suggest that other functions of Meq affect MDV virulence. These data improve our understanding of the mechanisms underlying the evolution of MDV virulence.

Enhancement of interleukin-2 production by bovine peripheral blood mononuclear cells treated with the combination of anti-programmed death-ligand 1 and cytotoxic T lymphocyte antigen 4 chimeric monoclonal antibodies.
Kei Watari, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Yamato Sajiki, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
The Journal of veterinary medical science, 84, 1, 6, 15, 2022年01月07日, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Our previous studies demonstrate the therapeutic efficacy against bovine diseases of an anti-bovine programmed death-ligand 1 (PD-L1) chimeric antibody. In humans, PD-1 and PD-L1 antibodies are more effective when combined with an antibody targeting cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) and these combination therapies are therefore clinically used. Here we generated an anti-bovine CTLA-4 chimeric antibody (chAb) to enhance the therapeutic efficacy of the PD-L1 antibody. We further analyzed the effects of dual blockade of CTLA-4 and PD-1 pathways on T-cell responses. The established anti-bovine CTLA-4 chAb showed comparable blocking activity on the binding of bovine CTLA-4 to CD80 and CD86 as the anti-bovine CTLA-4 mouse monoclonal antibody. Anti-bovine CTLA-4 chAb also significantly increased IL-2 production from bovine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Further, the combination of anti-CTLA-4 chAb with anti-PD-L1 chAb significantly upregulated IL-2 production by PBMCs. These results suggest that the combination of antibodies have higher potential to enhance immune responses against pathogens compared with single administration.

Characterization of a Novel Cysteine Protease Inhibitor from Poultry Red Mites: Potential Vaccine for Chickens
Sotaro Fujisawa, Shiro Murata, Masayoshi Isezaki, Takuma Ariizumi, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Osamu Ichii, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Vaccines, 9, 12, 1472, 1472, MDPI AG, 2021年12月13日
研究論文（学術雑誌）, Poultry red mite (PRM; Dermanyssus gallinae) is a hazardous, blood-sucking ectoparasite of birds that constitutes a threat to poultry farming worldwide. Acaricides, commonly used in poultry farms to prevent PRMs, are not effective because of the rapid emergence of acaricide-resistant PRMs. However, vaccination may be a promising strategy to control PRM. We identified a novel cystatin-like molecule in PRMs: Dg-Cys. Dg-Cys mRNA expression was detected in the midgut and ovaries, in all stages of life. The PRM nymphs that were artificially fed with the plasma from chickens that were immunized with Dg-Cys in vitro had a significantly reduced reproductive capacity and survival rate. Moreover, combination of Dg-Cys with other antigen candidates, like copper transporter 1 or adipocyte plasma membrane-associated protein, enhanced vaccine efficacies. vaccination and its application as an antigen for cocktail vaccines could be an effective strategy to reduce the damage caused by PRMs in poultry farming.

Tick saliva-induced programmed death-1 and PD-ligand 1 and its related host immunosuppression
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Yoshinori Ikenaka, Kevin Christian Montecillo Gulay, Atsushi Kobayashi, Luís Fernando Parizi, Benvindo Capela João, Kei Watari, Sotaro Fujisawa, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Carlos Logullo, Itabajara da Silva Vaz, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Scientific Reports, 11, 1, 1063, 1063, Springer Science and Business Media LLC, 2021年12月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The tick Rhipicephalus microplus is a harmful parasite of cattle that causes considerable economic losses to the cattle breeding industry. Although R. microplus saliva (Rm-saliva) contains several immunosuppressants, any association between Rm-saliva and the expression of immunoinhibitory molecules, such as programmed death (PD)-1 and PD-ligand 1 (PD-L1), has not been described. In this study, flow cytometric analyses revealed that Rm-saliva upregulated PD-1 expression in T cells and PD-L1 expression in CD14⁺ and CD11c⁺ cells in cattle. Additionally, Rm-saliva decreased CD69 expression in T cells and Th1 cytokine production from peripheral blood mononuclear cells. Furthermore, PD-L1 blockade increased IFN-γ production in the presence of Rm-saliva, suggesting that Rm-saliva suppresses Th1 responses via the PD-1/PD-L1 pathway. To reveal the upregulation mechanism of PD-1/PD-L1 by Rm-saliva, we analyzed the function of prostaglandin E₂ (PGE₂), which is known as an inducer of PD-L1 expression, in Rm-saliva. We found that Rm-saliva contained a high concentration of PGE₂, and PGE₂ treatment induced PD-L1 expression in CD14⁺ cells in vitro. Immunohistochemical analyses revealed that PGE₂ and PD-L1 expression was upregulated in tick-attached skin in cattle. These data suggest that PGE₂ in Rm-saliva has the potential to induce the expression of immunoinhibitory molecules in host immune cells.

Differential expression of PEPCK isoforms is correlated to Aedes aegypti oogenesis and embryogenesis
Renato Martins da Silva, Wagner Oliveira Vital, Ronald Sodre Martins, Jorge Moraes, Helga Gomes, Christiano Calixto, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Itabajara da Silva Vaz, Carlos Logullo
Comparative Biochemistry and Physiology Part - B: Biochemistry and Molecular Biology, 256, Elsevier Inc., 2021年10月01日
英語, 研究論文（学術雑誌）

In vitro characterization of adipocyte plasma membrane-associated protein from poultry red mites, Dermanyssus gallinae, as a vaccine antigen for chickens
Sotaro Fujisawa, Shiro Murata, Masaki Takehara, Julia Aoyama, Ayu Morita, Masayoshi Isezaki, Shwe Yee Win, Takuma Ariizumi, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Osamu Ichii, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Vaccine, 39, 41, 6057, 6066, Elsevier BV, 2021年10月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The poultry red mite (Dermanyssus gallinae; PRM) is a blood-sucking ectoparasite of chickens that is a threat to poultry farming worldwide and significantly reduces productivity in the egg-laying industry. Chemical acaricides that are widely used in poultry farms for the prevention of PRMs are frequently ineffective due to the emergence of acaricide-resistant PRMs. Therefore, alternative control methods are needed, and vaccination is a promising strategy for controlling PRMs. A novel adipocyte-plasma membrane-associated protein-like molecule (Dg-APMAP) is highly expressed in blood-fed PRMs according to a previous RNA sequencing analysis. Here, we attempted to identify the full sequence of Dg-APMAP, study its expression in different life stages of PRMs, and evaluate its potential as a vaccine antigen. Dg-APMAP mRNA was expressed in the midgut and ovaries, and in all life stages regardless of feeding states. Importantly, in vitro feeding of PRMs with plasma derived from chickens immunized with the recombinant protein of the extracellular region of Dg-APMAP significantly reduced their survival rate in nymphs and adults, which require blood meals. Our data suggest that the host immune responses induced by vaccination with Dg-APMAP could be an effective strategy to reduce the suffering caused by PRMs in the poultry industry.

Research Note: Characterization of S-Meq containing the deletion in Meq protein's transactivation domain in a Marek's disease virus strain in Japan.
Shiro Murata, Eiji Yamamoto, Natsumi Sakashita, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Poultry science, 100, 11, 101461, 101461, 2021年09月02日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Marek's disease virus (MDV) causes malignant lymphomas in chickens (Marek's disease; MD). Although MD has caused significant economic losses to the poultry industry, currently, its occurrence in the field is effectively controlled by vaccination. However, the genetic characteristics of MDV strains have changed, and the poultry industry has experienced MD outbreaks in vaccinated chickens because of enhanced virulence. Meq, an oncoprotein of MDV, is a key transcription factor correlated with the tumorigenesis in MD. Animal experiments using recombinant MDV revealed that distinct polymorphisms in Meq affect the virulence of MDV strains. Meq containing an insertion or deletion is present in some MDV strains. In the 2010s, field strains that encode Meq containing the deletion (S-Meq) were reported. In this study, we characterized the genetic features of S-Meq detected in a Japanese MDV strain and analyzed its transactivation activity to investigate S-Meq's protein function. S-Meq lacked 41 amino acids, and the deletion was at the same position as those observed in other countries. In addition, S-Meq exhibited higher transactivation activity than Meq from other MDV strains circulating in Japan. These results suggest that the deletion in the transactivation domain may enhance the Meq protein's function. Further investigation is needed to clarify whether the deletion in the transactivation domain of Meq affects MDV's virulence.

ウシCTLA-4ならびにPD-L1を標的とした抗体併用法による免疫増強効果の検討　　　　　　　　　　　　　　　
渡 慧, 今内 覚, 岡川 朋弘, 前川 直也, 村田 史郎, 鈴木 定彦, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DIO, 4], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

牛伝染性リンパ腫発症母牛における子宮内感染の解析　　　　　　　　　　　　　　　
嶋倉 穂南, 今内 覚, 岡川 朋弘, 中村 隼人, 神谷 可菜, 齋藤 麻矢, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DVO, 5], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

マレック病ウイルスMeqタンパク質における挿入および欠損配列の病原性への影響　　　　　　　　　　　　　　　
佐藤 純平, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 瀬尾 光里, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DVO, 25], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

ワクモ(Dermanyssus gallinae)由来システインプロテアーゼの抗ワクモワクチン抗原としての評価　　　　　　　　　　　　　　　
有泉 拓馬, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 伊勢崎 政美, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 市居 修, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [EO, 6], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

鼻疽に対する診断用抗原の探索および血清診断法の確立　　　　　　　　　　　　　　　
飯沼 由希帆, 岡川 朋弘, 市川 世識, 陸 拾七, 前川 直也, 村田 史郎, 今内 覚, 木村 亨史, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DIO, 2], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

Expression and functional analysis of swine PD-1/PD-L1 pathway(和訳中)　　　　　　　　　　　　　　　
Otgontuya Ganbaatar, 今内 覚, 岡川 朋弘, 野島 裕太郎, 前川 直也, 市川 世識, 小林 篤史, 芝原 友幸, 柳川 洋二郎, 鈴木 定彦, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DIO, 3], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
英語

ウシCTLA-4ならびにPD-L1を標的とした抗体併用法による免疫増強効果の検討　　　　　　　　　　　　　　　
渡 慧, 今内 覚, 岡川 朋弘, 前川 直也, 村田 史郎, 鈴木 定彦, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DIO, 4], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

牛伝染性リンパ腫発症母牛における子宮内感染の解析　　　　　　　　　　　　　　　
嶋倉 穂南, 今内 覚, 岡川 朋弘, 中村 隼人, 神谷 可菜, 齋藤 麻矢, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DVO, 5], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

マレック病ウイルスMeqタンパク質における挿入および欠損配列の病原性への影響　　　　　　　　　　　　　　　
佐藤 純平, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 瀬尾 光里, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [DVO, 25], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

ワクモ(Dermanyssus gallinae)由来システインプロテアーゼの抗ワクモワクチン抗原としての評価　　　　　　　　　　　　　　　
有泉 拓馬, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 伊勢崎 政美, 佐藤 匠, 大石 英司, 種子野 章, 市居 修, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164回, [EO, 6], (公社)日本獣医学会, 2021年09月
日本語

Programmed death‐ligand 1 expression in swine chronic infections and enhancement of interleukin‐2 production via programmed death‐1/programmed death‐ligand 1 blockade
Otgontuya Ganbaatar, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Yutaro Nojima, Naoya Maekawa, Yoshiki Ichikawa, Atsushi Kobayashi, Tomoyuki Shibahara, Yojiro Yanagawa, Hidetoshi Higuchi, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Immunity, Inflammation and Disease, Wiley, 2021年08月20日
研究論文（学術雑誌）

Prostaglandin-related immune suppression in cattle
Y. Sajiki, S. Konnai, Y. Ikenaka, T. Okagawa, N. Maekawa, C. Logullo, I. da Silva Vaz, S. Murata, K. Ohashi
Veterinary Immunology and Immunopathology, 236, 110238, 110238, Elsevier BV, 2021年06月
研究論文（学術雑誌）

Selection of reference genes for quantitative PCR analysis in poultry red mite (Dermanyssus gallinae).
Takuma Ariizumi, Shiro Murata, Sotaro Fujisawa, Masayoshi Isezaki, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
The Journal of veterinary medical science, 83, 4, 558, 565, 2021年04月09日, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Poultry red mites (PRMs, Dermanyssus gallinae) are harmful ectoparasites that affect farmed chickens and cause serious economic losses in the poultry industry worldwide. Acaricides are used for PRM control; however, some PRMs have developed acaricide-resistant properties, which have indicated the need for different approaches for PRM control. Therefore, it is necessary to elucidate the biological status of PRMs to develop alternative PRM control strategies. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) allows analysis of the biological status at the transcript level. However, reference genes are preferable for accurate comparison of expression level changes given the large variation in the quality of the PRM samples collected in each farm. This study aimed to identify candidate reference genes with stable expression levels in the different blood feeding states and life stages of PRMs. First, we selected candidates based on the following criteria: sufficient expression intensity and no significant expression difference between fed and starved states. We selected and characterized seven candidate reference genes. Among them, we evaluated the gene expression stability between the starved and fed states using RefFinder; moreover, we compared their expression levels in each life-stage and identified two reference genes, Elongation factor 1-alpha (ELF1A)-like and apolipophorins-like. Finally, we evaluated the utility of the candidates as reference genes, and the use of ELF1A-like and apolipophorins-like successfully normalized ATP synthase subunit g -like gene expression. Thus, ELF1A-like and apolipophorins-like could be suitable reference genes in PRMs.

Direct evidence of the preventive effect of milk replacer–based probiotic feeding in calves against severe diarrhea
Fumi Kayasaki, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Junko Kohara, Yamato Sajiki, Kei Watari, Otgontuya Ganbaatar, Shinya Goto, Hayato Nakamura, Honami Shimakura, Erina Minato, Atsushi Kobayashi, Manabu Kubota, Nobuhiro Terasaki, Akira Takeda, Haruka Noda, Mitsuru Honma, Naoya Maekawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Veterinary Microbiology, 254, 108976, 108976, Elsevier BV, 2021年03月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Diarrhea is a major cause of death in calves and this is linked directly to economic loss in the cattle industry. Fermented milk replacer (FMR) has been used widely in clinical settings for calf feeding to improve its health and growth. However, the protective efficacy of FMR on calf diarrhea remains unclear. In this study, we verified the preventive effects of FMR feeding on calf diarrhea using an experimental infection model of bovine rotavirus (BRV) in newborn calves and a field study in dairy farms with calf diarrhea. In addition, we evaluated the protective efficacy of lactic acid bacteria-supplemented milk replacer (LAB-MR) in an experimental infection model. In the experimental infection, calves fed FMR or high-concentrated LAB-MR had diarrhea, but the water content of feces was lower and more stable than that of calves fed normal milk replacer. The amount of milk intake also decreased temporarily, but recovered immediately in the FMR- and LAB-MR-fed calves. As compared with the control calves, FMR- or LAB-MR-fed calves showed less severe or reduced histopathological lesions of enteritis in the intestinal mucosa. In a field study using dairy calves, FMR feeding significantly reduced the incidence of enteritis, mortality from enteritis, duration of a series of treatment for enteritis, number of consultations, and cost of medical care for the disease. These results suggest that feeding milk replacer-based probiotics to calves reduces the severity of diarrhea and tissue damage to the intestinal tract caused by BRV infection and provides significant clinical benefits to the prevention and treatment of calf diarrhea.

PD-L1 immunohistochemistry for canine cancers and clinical benefit of anti-PD-L1 antibody in dogs with pulmonary metastatic oral malignant melanoma.
Naoya Maekawa, Satoru Konnai, Maki Nishimura, Yumiko Kagawa, Satoshi Takagi, Kenji Hosoya, Hiroshi Ohta, Sangho Kim, Tomohiro Okagawa, Yusuke Izumi, Tatsuya Deguchi, Yukinari Kato, Satoshi Yamamoto, Keiichi Yamamoto, Mikihiro Toda, Chie Nakajima, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
NPJ precision oncology, 5, 1, 10, 10, 2021年02月12日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Immunotherapy targeting programmed cell death 1 (PD-1) and PD-ligand 1 (PD-L1) represents promising treatments for human cancers. Our previous studies demonstrated PD-L1 overexpression in some canine cancers, and suggested the therapeutic potential of a canine chimeric anti-PD-L1 monoclonal antibody (c4G12). However, such evidence is scarce, limiting the clinical application in dogs. In the present report, canine PD-L1 expression was assessed in various cancer types, using a new anti-PD-L1 mAb, 6C11-3A11, and the safety and efficacy of c4G12 were explored in 29 dogs with pulmonary metastatic oral malignant melanoma (OMM). PD-L1 expression was detected in most canine malignant cancers including OMM, and survival was significantly longer in the c4G12 treatment group (median 143 days) when compared to a historical control group (n = 15, median 54 days). In dogs with measurable disease (n = 13), one dog (7.7%) experienced a complete response. Treatment-related adverse events of any grade were observed in 15 dogs (51.7%). Here we show that PD-L1 is a promising target for cancer immunotherapy in dogs, and dogs could be a useful large animal model for human cancer research.

Intrauterine infection with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in pregnant cattle diagnosed with Johne's disease
Yukiko Taniguchi, Satoru Konnai, Shinichi Sakakibara, Ayano Yamamoto, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 69, 1, 51, 55, 2021年02月
英語, 研究論文（学術雑誌）

Cross-species reactivity of antibodies against Ixodes persulcatus ferritin 2 to Rhipicephalus microplus
Marina Amaral Xavier, Satoru Konnai, Luis Fernando Parizi, Naftaly Wangombe Githaka, Masayoshi Isezaki, Shinya Goto, Sotaro Fujisawa, Shinji Yamada, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Carlos Logullo, Itabajara da Silva Vaz Jr, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 69, 1, 57, 65, 2021年02月
英語, 研究論文（学術雑誌）

Characterization of a copper transporter 1 from Dermanyssus gallinae as a vaccine antigen
Sotaro Fujisawa, Shiro Murata, Masayoshi Isezaki, Takuma Ariizumi, Takumi Sato, Eiji Oishi, Akira Taneno, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Osamu Ichii, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Parasitology, 2021年
研究論文（学術雑誌）

Canine Transforming Growth Factor-β Receptor 2-Ig: A Potential Candidate Biologic for Melanoma Treatment That Reverses Transforming Growth Factor-β1 Immunosuppression.
Hiroto Takeuchi, Satoru Konnai, Naoya Maekawa, Satoshi Takagi, Hiroshi Ohta, Noboru Sasaki, Sangho Kim, Tomohiro Okagawa, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Frontiers in veterinary science, 8, 656715, 656715, 2021年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Cancer cells can evade host immune systems via multiple mechanisms. Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) is an immunosuppressive cytokine that induces regulatory T cell (Tregs) differentiation and is involved in immune evasion mechanisms in cancer. The inhibition of the TGF-β1 signaling pathway can suppress cancer progression and metastasis through the modulation of anticancer immune responses. However, to best of our knowledge, no implementation of treatments targeting TGF-β1 has been reported in dog cancers. This study aimed to examine whether TGF-β1 is upregulated in canine cancers. We measured TGF-β1 concentrations in culture supernatants of canine melanoma cell lines and in serum samples from dogs with oral malignant melanoma. TGF-β1 production was observed in several cell lines, and serum TGF-β1 levels were elevated in dogs with oral malignant melanoma. Interestingly, the addition of recombinant TGF-β1 to canine peripheral blood mononuclear cell cultures decreased Th1 cytokine production and increased differentiation of CD4+CD25+Foxp3+ lymphocytes, suggesting that TGF-β1 is immunosuppressive in canine immune systems. We developed a decoy receptor for TGF-β, namely TGF-βRII-Ig, by identifying an open reading frame of the canine TGFBR2 gene. TGF-βRII-Ig was prepared as a recombinant fusion protein of the extracellular region of canine TGF-βRII and the Fc region of canine IgG-B. As expected, TGF-βRII-Ig bound to TGF-β1. In the presence of TGF-β1, the treatment with TGF-βRII-Ig increased Th1 cytokine production and decreased the differentiation of CD4+CD25+Foxp3+ lymphocytes. Our results suggest that TGF-βRII-Ig competitively inhibits the immunosuppressive effects of TGF-β1 and thereby activates immune responses. This study demonstrated the potential of TGF-βRII-Ig as a novel biologic for canine melanoma.

Characterisation of a cysteine protease from poultry red mites and its potential use as a vaccine for chickens.
Shiro Murata, Ayaka Taniguchi, Masayoshi Isezaki, Sotaro Fujisawa, Eishi Sakai, Akira Taneno, Osamu Ichii, Takuya Ito, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Parasite (Paris, France), 28, 9, 9, 2021年, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Poultry red mites (PRMs, Dermanyssus gallinae) are ectoparasites that negatively affect farmed chickens, leading to serious economic losses worldwide. Acaricides have been used to control PRMs in poultry houses. However, some PRMs have developed resistance to acaricides, and therefore different approaches are required to manage the problems caused by PRMs. Vaccination of chickens is one of the methods being considered to reduce the number of PRMs in poultry houses. In a previous study, a cysteine protease, Deg-CPR-1, was identified as a candidate vaccine against PRMs distributed in Europe. In this study, we investigated the characteristics of Deg-CPR-1. A phylogenetic analysis revealed that Deg-CPR-1 is closely related to the digestive cysteine proteases of other mite species, and it was classified into a cluster different from that of chicken cathepsins. Deg-CPR-1 of PRMs in Japan has an amino acid substitution compared with that of PRMs in Europe, but it showed efficacy as a vaccine, consistent with previous findings. Deg-CPR-1 exhibited cathepsin L-like enzyme activity. In addition, the Deg-CPR-1 mRNA was expressed in the midgut and in all stages of PRMs that feed on blood. These results imply that Deg-CPR-1 in the midgut may have important functions in physiological processes, and the inhibition of its expression may contribute to the efficacy of a Deg-CPR-1-based vaccine. Further research is required to fully understand the mechanisms of vaccine efficacy.

The enhancement of Th1 immune response by anti-PD-L1 antibody in cattle infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
Yamato SAJIKI, Satoru KONNAI, Reiko NAGATA, Satoko KAWAJI, Hayato NAKAMURA, Sotaro FUJISAWA, Tomohiro OKAGAWA, Naoya MAEKAWA, Yukinari KATO, Yasuhiko SUZUKI, Shiro MURATA, Yasuyuki MORI, Kazuhiko OHASHI
Journal of Veterinary Medical Science, 83, 2, 162, 166, Japanese Society of Veterinary Science, 2021年, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Johne's disease, caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), is a chronic enteritis of ruminants. Previous studies have shown that programmed death-ligand 1 (PD-L1) is associated with the disease progression, and PD-L1 blockade activates MAP-specific Th1 responses in vitro. Here, we performed anti-PD-L1 antibody administration using 2 MAP-infected cattle at the late subclinical stage of infection. After administration, bacterial shedding was reduced or maintained at a low level. Additionally, MAP-specific Th1 cytokine production was upregulated, and CD69 expression was increased in T cells. Collectively, the treatment has a potential as a novel control method against Johne's disease.

A TLR7 agonist activates bovine Th1 response and exerts antiviral activity against bovine leukemia virus
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Hayato Nakamura, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Developmental & Comparative Immunology, 114, 103847, 103847, Elsevier BV, 2021年01月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine leukemia virus (BLV) infection is a bovine chronic infection caused by BLV, a member of the genus Deltaretrovirus. In this study, we examined the immunomodulatory effects of GS-9620, a toll-like receptor (TLR) 7 agonist, in cattle (Bos taurus) and its therapeutic potential for treating BLV infection. GS-9620 induced cytokine production in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as CD80 expression in CD11c+ cells and increased CD69 and interferon (IFN)-γ expressions in T cells. Removing CD11c+ cells from PBMCs decreased CD69 expression in T cells in the presence of GS-9620. These results suggest that TLR7 agonism promotes T-cell activation via CD11c+ cells. Analyses using PBMCs from BLV-infected cattle revealed that TLR7 expression in CD11c+ cells was upregulated during late-stage BLV infection. Furthermore, GS-9620 increased IFN-γ and TNF-α production and inhibited syncytium formation in vitro, suggesting that GS-9620 may be used to treat BLV infection.

The Suppression of Th1 Response by Inducing TGF-β1 From Regulatory T Cells in Bovine Mycoplasmosis
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Shinya Goto, Tomohiro Okagawa, Kosuke Ohira, Honami Shimakura, Naoya Maekawa, Satoshi Gondaira, Hidetoshi Higuchi, Motoshi Tajima, Yuki Hirano, Junko Kohara, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Frontiers in Veterinary Science, 7, 609443, 609443, Frontiers Media SA, 2020年12月02日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Regulatory T cells (Tregs) regulate immune responses and maintain host immune homeostasis. Tregs contribute to the disease progression of several chronic infections by oversuppressing immune responses via the secretion of immunosuppressive cytokines, such as transforming growth factor (TGF)-β and interleukin-10. In the present study, we examined the association of Tregs with Mycoplasma bovis infection, in which immunosuppression is frequently observed. Compared with uninfected cattle, the percentage of Tregs, CD4⁺CD25^highFoxp3⁺ T cells, was increased in M. bovis-infected cattle. Additionally, the plasma of M. bovis-infected cattle contained the high concentrations of TGF-β1, and M. bovis infection induced TGF-β1 production from bovine immune cells in in vitro cultures. Finally, we analyzed the immunosuppressive effects of TGF-β1 on bovine immune cells. Treatment with TGF-β1 significantly decreased the expression of CD69, an activation marker, in T cells, and Th1 cytokine production in vitro. These results suggest that the increase in Tregs and TGF-β1 secretion could be one of the immunosuppressive mechanisms and that lead to increased susceptibility to other infections in terms of exacerbation of disease during M. bovis infection.

Molecular detection and genetic characterization of infectious laryngotracheitis virus in poultry in Myanmar
Zhiyuan Yang, Shiro Murata, Sotaro Fujisawa, Masaki Takehara, Ken Katakura, Myint Myint Hmoon, Shwe Yee Win, Saw Bawm, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
BMC Veterinary Research, 16, 1, 453, 453, Springer Science and Business Media LLC, 2020年12月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）,

Avian infectious laryngotracheitis (ILT) is a highly contagious viral disease that causes severe economic losses to the poultry industry worldwide. In Southeast Asian countries, including Myanmar, poultry farming is a major industry. Although it is known that infectious respiratory pathogens, including infectious laryngotracheitis virus (ILTV), are a major threat to poultry farms, there are no data currently available on the epidemiology of ILTV in Myanmar. Therefore, in this study, we conducted a molecular detection of ILTV in 20 poultry farms in Myanmar.




Of the 57 tested oropharyngeal swabs, 10 were positive for ILTV by polymerase chain reaction of a 647 bp region of the thymidine kinase (TK) gene, giving a prevalence of ILTV of 17.5% (10/57). Further sequencing analysis of infected cell protein 4 (ICP4) gene and glycoprotein B, G, and J (gB, gG, and gJ) genes indicated that these isolates were field strains. Phylogenetic analysis revealed that the Myanmar strains clustered together in a single branch and were closely related to other reference strains isolated from Asian countries.




This study demonstrated the presence of ILTV in poultry farms in Myanmar. The genetic characterization analysis performed provides the fundamental data for epidemiological studies that monitor circulating strains of ILTV in Myanmar.

Enhanced Immunotherapeutic Efficacy of Anti–PD-L1 Antibody in Combination with an EP4 Antagonist
Yamato Sajiki, Satoru Konnai, Zimeng Cai, Kensuke Takada, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Sotaro Fujisawa, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
ImmunoHorizons, 4, 12, 837, 850, The American Association of Immunologists, 2020年12月01日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Combination treatment approaches are increasingly considered to overcome resistance to immunotherapy targeting immunoinhibitory molecules such as programmed death (PD)-1 and PD-ligand 1 (PD-L1). Previous studies have demonstrated that the therapeutic efficacy of anti-PD-L1 Abs is enhanced by combination treatment with cyclooxygenase-2 inhibitors, through downregulation of the immunosuppressive eicosanoid PGE2, although the underlying mechanism remains unclear. In this study, we show that serum PGE2 levels are upregulated after anti-PD-L1 Ab administration in a bovine model of immunotherapy and that PGE2 directly inhibits T cell activation via its receptor E prostanoid (EP) 4. Additionally, anti-PD-L1 Ab induces TNF-α production and TNF-α blockade reduces PGE2 production in the presence of anti-PD-L1 Ab, suggesting that anti-PD-L1 Ab-induced TNF-α impairs T cell activation by PGE2 upregulation. Our studies examining the therapeutic potential of the dual blockade of PD-L1 and EP4 in bovine and murine immune cells reveal that the dual blockade of PD-L1 and EP4 significantly enhances Th1 cytokine production in vitro. Finally, we show that the dual blockade decreases tumor volume and prolongs survival in mice inoculated with the murine lymphoma cell line EG7. Altogether, these results suggest that TNF-α induced by anti-PD-L1 Ab treatment is associated with T cell dysfunction via PGE2/EP4 pathway and that the dual blockade of PD-L1 and EP4 should be considered as a novel immunotherapy for cancer.

Genetic characterization of a Marek’s disease virus strain isolated in Japan
Shiro Murata, Yuka Machida, Masayoshi Isezaki, Naoya Maekawa, Tomohiro Okagawa, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi
Virology Journal, 17, 1, 186, 186, Springer Science and Business Media LLC, 2020年12月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）,

Marek’s disease virus (MDV) causes malignant lymphomas in chickens (Marek’s disease, MD). MD is currently controlled by vaccination; however, MDV strains have a tendency to develop increased virulence. Distinct diversity and point mutations are present in the Meq proteins, the oncoproteins of MDV, suggesting that changes in protein function induced by amino acid substitutions might affect MDV virulence. We previously reported that recent MDV isolates in Japan display distinct mutations in Meq proteins from those observed in traditional MDV isolates in Japan, but similar to those in MDV strains isolated from other countries.




To further investigate the genetic characteristics in Japanese field strains, we sequenced the whole genome of an MDV strain that was successfully isolated from a chicken with MD in Japan. A phylogenetic analysis of the meq gene was also performed.




Phylogenetic analysis revealed that the Meq proteins in most of the Japanese isolates were similar to those of Chinese and European strains, and the genomic sequence of the Japanese strain was classified into the Eurasian cluster. Comparison of coding region sequences among the Japanese strain and MDV strains from other countries revealed that the genetic characteristics of the Japanese strain were similar to those of Chinese and European strains.




The MDV strains distributed in Asian and European countries including Japan seem to be genetically closer to each other than to MDV strains from North America. These findings indicate that the genetic diversities of MDV strains that emerged may have been dependent on the different vaccination-based control approaches.

PD-L1 expression in equine malignant melanoma and functional effects of PD-L1 blockade
Otgontuya Ganbaatar, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Yutaro Nojima, Naoya Maekawa, Erina Minato, Atsushi Kobayashi, Ryo Ando, Nobuya Sasaki, Daisuke Miyakoshi, Osamu Ichii, Yukinari Kato, Yasuhiko Suzuki, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
PLOS ONE, 15, 11, e0234218, e0234218, Public Library of Science (PLoS), 2020年11月20日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Programmed death-1 (PD-1) is an immunoinhibitory receptor expressed on lymphocytes. Interaction of PD-1 with its ligand PD-ligand 1 (PD-L1) delivers inhibitory signals and impairs proliferation, cytokine production, and cytotoxicity of T cells. In our previous studies, we have developed anti-bovine PD-L1 monoclonal antibodies (mAbs) and reported that the PD-1/PD-L1 pathway was closely associated with T-cell exhaustion and disease progression in bovine chronic infections and canine tumors. Furthermore, we found that blocking antibodies that target PD-1 and PD-L1 restore T-cell functions and could be used in immunotherapy in cattle and dogs. However, the immunological role of the PD-1/PD-L1 pathway for chronic equine diseases, including tumors, remains unclear. In this study, we identified cDNA sequences of equine PD-1 (EqPD-1) and PD-L1 (EqPD-L1) and investigated the role of anti-bovine PD-L1 mAbs against EqPD-L1 using in vitro assays. In addition, we evaluated the expression of PD-L1 in tumor tissues of equine malignant melanoma (EMM). The amino acid sequences of EqPD-1 and EqPD-L1 share a considerable identity and similarity with homologs from non-primate species. Two clones of the anti-bovine PD-L1 mAbs recognized EqPD-L1 in flow cytometry, and one of these cross-reactive mAbs blocked the binding of equine PD-1/PD-L1. Of note, immunohistochemistry confirmed the PD-L1 expression in EMM tumor tissues. A cultivation assay revealed that PD-L1 blockade enhanced the production of Th1 cytokines in equine immune cells. These findings showed that our anti-PD-L1 mAbs would be useful for analyzing the equine PD-1/PD-L1 pathway. Further research is warranted to discover the immunological role of PD-1/PD-L1 in chronic equine diseases and elucidate a future application in immunotherapy for horses.

Identification and functional analysis of ferritin 2 from the Taiga tick Ixodes persulcatus Schulze
Naftaly Wang'ombe Githaka, Satoru Konnai, Masayoshi Isezaki, Shinya Goto, Marina Amaral Xavier, Sotaro Fujisawa, Shinji Yamada, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Carlos Logullo, Itabajara da Silva Vaz, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Ticks and Tick-borne Diseases, 11, 6, 101547, 101547, Elsevier BV, 2020年11月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Ferritin 2 (FER2) is an iron storage protein, which has been shown to be critical for iron homeostasis during blood feeding and reproduction in ticks and is therefore suitable as a component for anti-tick vaccines. In this study, we identified the FER2 of Ixodes persulcatus, a major vector for zoonotic diseases such as Lyme borreliosis and tick-borne relapsing fever in Japan, and investigated its functions. Ixodes persulcatus-derived ferritin 2 (Ip-FER2) showed concentration-dependent iron-binding ability and high amino acid conservation, consistent with FER2s of other tick species. Vaccines containing the recombinant Ip-FER2 elicited a significant reduction of the engorgement weight of adult I. persulcatus. Interestingly, the reduction of engorgement weight was also observed in Ixodes ovatus, a sympatric species of I. persulcatus. In silico analyses of FER2 sequences of I. persulcatus and other ticks showed a greater similarity with I. scapularis and I. ricinus and lesser similarity with Hyalomma anatolicum, Haemaphysalis longicornis, Rhipicephalus microplus, and R. appendiculatus. Moreover, it was observed that the tick FER2 sequences possess conserved regions within the primary structures, and in silico epitope mapping analysis revealed that antigenic regions were also conserved, particularly among Ixodes spp ticks. In conclusion, the data support further protective tick vaccination applications using the Ip-FER2 antigens identified herein.

牛白血病ウイルス感染症における免疫抑制受容体TIM-3の発現解析および機能解析　　　　　　　　　　　　　　　
中村 隼人, 今内 覚, 岡川 朋弘, 佐治木 大和, 渡 慧, 神谷 可菜, 齋藤 麻矢, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 163回, 221, 221, (公社)日本獣医学会, 2020年10月
日本語

ネコCytotoxic T-lymphocyte antigen-4(CTLA-4)を標的とした新規免疫抑制剤の開発における基礎的検討　　　　　　　　　　　　　　　
大塚 拓海, 今内 覚, 前川 直也, 渡 慧, 岡川 朋弘, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 163回, 221, 221, (公社)日本獣医学会, 2020年10月
日本語

ワクモにおける定量的PCR法確立のための内在性コントロール遺伝子の探索　　　　　　　　　　　　　　　
有泉 拓馬, 村田 史郎, 藤澤 宗太郎, 伊勢崎 政美, 前川 直也, 岡川 朋弘, 種子野 章, 大石 英司, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 163回, 248, 248, (公社)日本獣医学会, 2020年10月
日本語

Transcriptome dynamics of blood-fed and starved poultry red mites, Dermanyssus gallinae　　　　　　　　　　　　　　　
Fujisawa S, Murata S, Isezaki M, Oishi E, Taneno A, Maekawa N, Okagawa T, Konnai S, Ohashi K
Parasitol Int., 102156, 102156, 2020年06月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Immunosuppressive Effects of Sialostatins L and L2 Isolated from the Taiga Tick Ixodes persulcatus Schulze　　　　　　　　　　　　　　　
Sajiki Y, Konnai S, Ochi A, Okagawa T, Githaka N, Isezaki M, Yamada S, Ito T, Ando S, Kawabata H, Da Silva Vaz Jr I, Logullo C, Maekawa N, Murata S, Ohashi K
Ticks Tick born Dis., 11, 2, 101332., 2020年03月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Expression Analysis of Canine CMTM6 and CMTM4 as Potential Regulators of the PD-L1 Protein in Canine Cancers
Hiroto Takeuchi, Satoru Konnai, Naoya Maekawa, Erina Minato, Atsushi Kobayashi, Tomohiro Okagawa, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Front Vet Sci, 7, 330, 330, 2020年, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Cancer is one of the most significant causes of death in dogs. Antibody drugs targeting the PD-1/PD-L1 axis represent a promising immunotherapy for both human and canine cancers. However, the regulation mechanisms of PD-L1 expression in canine cancers require further investigation to better understand the resistance mechanisms to anti-PD-L1 therapy. Recent reports have shown that CMTM6 and CMTM4 are critical regulators of PD-L1 protein expression in human cancer cells. By preventing PD-L1 from lysosome-mediated degradation, CMTM6 maintains PD-L1 expression on the cell surface. However, the literature has not reported on CMTM6 and CMTM4 in dogs, and their functions are completely unknown. To reveal a regulation mechanism of PD-L1 in canine cancers, this study firstly identified the gene sequences of CMTM6 and CMTM4. Then, the expression analysis of these proteins was performed by immunohistochemistry. Furthermore, the functions of CMTM6 and CMTM4 in regulating PD-L1 expression were examined by gene knockdown of CMTM6 and CMTM4. Canine CMTM6 and CMTM4 displayed high amino acid sequence identities compared with those of humans and mice. An immunohistochemical analysis using cross-reactive antibodies revealed that canine malignant melanoma and osteosarcoma express CMTM6, CMTM4, and PD-L1 simultaneously. Gene knockdown of CMTM6 and CMTM4 with RNA interference significantly reduced the cell surface expression of PD-L1 in a canine cell line. These results suggest that CMTM6 and CMTM4 are regulators of PD-L1 expression in canine cancers and could serve as potential therapeutic targets to enhance antitumor immunity.

Rhipicephalus microplus cystatin as a potential cross-protective tick vaccine against Rhipicephalus appendiculatus　　　　　　　　　　　　　　　
Parizi L, Rangel C, Sabadina G, Saggin B, Kiio I, Xavier M, Matos R, Camargo-Mathias M, Seixas A, Konnai S, Ohashi K, Githaka N, da Silva Vaz Jr I
Tick Tick born Dise, in press, 2020年01月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Upregulation of PD-L1 expression by prostaglandin E2 and the enhancement of IFN-γ by anti-PD-L1 antibody combined with a COX-2 inhibitor in Mycoplasma bovis infection
Goto S, Konnai S, Hirano Y, Kohara J, Okagawa T, Maekawa N, Sajiki Y, Watari K, Minato E, Kobayashi A, Gondaira S, Higuchi H, Koiwa M, Tajima M, Taguchi E, Uemura R, Yamada S, Kaneko M, Kato Y, Yamamoto K, Toda M, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Front Vet Sci, 7, 12, 12, 2020年, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine mycoplasmosis caused by Mycoplasma bovis results in pneumonia and mastitis in cattle. We previously demonstrated that the programmed death 1 (PD-1)/PD-ligand 1 (PD-L1) pathway is involved in immune dysfunction during M. bovis infection and that prostaglandin E2 (PGE2) suppressed immune responses and upregulated PD-L1 expression in Johne's disease, a bacterial infection in cattle. In this study, we investigated the role of PGE2 in immune dysfunction and the relationship between PGE2 and the PD-1/PD-L1 pathway in M. bovis infection. In vitro stimulation with M. bovis upregulated the expressions of PGE2 and PD-L1 presumably via Toll-like receptor 2 in bovine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). PGE2 levels of peripheral blood in infected cattle were significantly increased compared with those in uninfected cattle. Remarkably, plasma PGE2 levels were positively correlated with the proportions of PD-L1+ monocytes in M. bovis-infected cattle. Additionally, plasma PGE2 production in infected cattle was negatively correlated with M. bovis-specific interferon (IFN)-γ production from PBMCs. These results suggest that PGE2 could be one of the inducers of PD-L1 expression and could be involved in immunosuppression during M. bovis infection. In vitro blockade assays using anti-bovine PD-L1 antibody and a cyclooxygenase 2 inhibitor significantly upregulated the M. bovis-specific IFN-γ response. Our study findings might contribute to the development of novel therapeutic strategies for bovine mycoplasmosis that target PGE2 and the PD-1/PD-L1 pathway.

Clinical efficacy of the combined treatment of anti-PD-L1 rat-bovine chimeric antibody with a COX-2 inhibitor in calves infected with Mycoplasma bovis　　　　　　　　　　　　　　　
Goto S, Konnai S, Hirano Y, Kohara J, Okagawa T, Maekawa N, Sajiki Y, Watari K, Minato E, Kobayashi A, Gondaira S, Higuchi H, Koiwa M, Tajima M, Taguchi E, Ishida M, Uemura R, Yamada S, Kaneko M, Kato Y, Yamamoto K, Toda M, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Jpn J Vet Res, 2020年, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular detection and genetic characterization of Mycoplasma gallisepticum, Mycoplama synoviae, and infectious bronchitis virus in poultry in Myanmar
Sotaro Fujisawa, Shiro Murata, Masaki Takehara, Ken Katakura, Myint Myint Hmoon, Shwe Yee Win, Kazuhiko Ohashi
BMC Veterinary Research, 15, 1, 261, 261, Springer Science and Business Media LLC, 2019年12月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, BACKGROUND: In Southeast Asian countries, including Myanmar, poultry farming is a major industry. In order to manage and maintain stable productivity, it is important to establish policies for biosecurity. Infectious respiratory diseases are a major threat to poultry farming. Avian influenza and Newcastle disease have been reported in Myanmar, but no scientific information is available for other respiratory pathogens, such as mycoplasmas and infectious bronchitis virus (IBV). Identifying the genotypes and serotypes of IBVs is especially important to inform vaccination programs. In this study, we detected Mycoplasma gallisepticum (MG), M. synoviae (MS), and IBV in several poultry farms in Myanmar. RESULTS: Samples were collected from 20 farms in three major poultry farming areas in Myanmar, and MG, MS, and IBV were detected on two, four, and eight farms, respectively, by polymerase chain reaction. Phylogenetic analysis revealed that the observed MG and MS isolates were not identical to vaccine strains. Three different genotypes of IBV were detected, but none was an unknown variant. CONCLUSIONS: Mycoplasmas and IBV were detected on poultry farms in Myanmar. Periodic surveillance is required to establish the distribution of each pathogen, and to institute better vaccine protocols.

Immune inhibitory function of bovine CTLA-4 and the effects of its blockade in IFN-γ production　　　　　　　　　　　　　　　
Watari K, Konnai S, Maekawa N, Okagawa T, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
BMC Vet Res, 15, 1, 380, 2019年09月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Prostaglandin E2 induced immune exhaustion and enhancement of anti-viral effects by anti-PD-L1 antibody combined with COX-2 inhibitor in bovine leukemia virus infection
Sajiki Y, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Goto S, Watari K, Minato E, Kobayashi A, Kohara J, Yamada S, Kato Y, Takahashi H, Terasaki N, Takeda A, Yamamoto K, Toda M, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
J Immunol, 203, 5, 1313, 1324, 2019年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine leukemia virus (BLV) infection is a chronic viral infection of cattle and endemic in many countries, including Japan. Our previous study demonstrated that PGE2, a product of cyclooxygenase (COX) 2, suppresses Th1 responses in cattle and contributes to the progression of Johne disease, a chronic bacterial infection in cattle. However, little information is available on the association of PGE2 with chronic viral infection. Thus, we analyzed the changes in plasma PGE2 concentration during BLV infection and its effects on proviral load, viral gene transcription, Th1 responses, and disease progression. Both COX2 expression by PBMCs and plasma PGE2 concentration were higher in the infected cattle compared with uninfected cattle, and plasma PGE2 concentration was positively correlated with the proviral load. BLV Ag exposure also directly enhanced PGE2 production by PBMCs. Transcription of BLV genes was activated via PGE2 receptors EP2 and EP4, further suggesting that PGE2 contributes to disease progression. In contrast, inhibition of PGE2 production using a COX-2 inhibitor activated BLV-specific Th1 responses in vitro, as evidenced by enhanced T cell proliferation and Th1 cytokine production, and reduced BLV proviral load in vivo. Combined treatment with the COX-2 inhibitor meloxicam and anti-programmed death-ligand 1 Ab significantly reduced the BLV proviral load, suggesting a potential as a novel control method against BLV infection. Further studies using a larger number of animals are required to support the efficacy of this treatment for clinical application.

ミャンマーの養鶏場におけるマイコプラズマ、鶏伝染性気管支炎ウイルス、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスの分子学的検出と遺伝学的性状解析(Molecular detection and genetic characterization of mycoplasmas, infectious bronchitis virus and infectious laryngotracheitis virus in poultry farms in Myanmar)　　　　　　　　　　　　　　　
Yang Zhiyuan, 藤澤 宗太郎, 村田 史郎, 竹原 昌生, 片倉 賢, Myint Myint Hmoon, Shwe Yee Win, Saw Bawm, Lat Lat Htun, Ye Htut Aung, Mar Mar Win, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 411, 411, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
英語

イヌ腫瘍組織およびイヌ腫瘍由来細胞株におけるイヌHER2の発現解析　　　　　　　　　　　　　　　
吉武 志江奈, 今内 覚, 前川 直也, 賀川 由美子, 西村 麻紀, 岡川 朋弘, 鈴木 定彦, 高木 哲, 中川 貴之, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 380, 380, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
日本語

イヌ腫瘍由来細胞株におけるCKLF-like MARVEL transmembrane domain containing protein 6(CMTM6)および4(CMTM4)の発現解析　　　　　　　　　　　　　　　
竹内 寛人, 今内 覚, 岡川 朋弘, 前川 直也, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 380, 380, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
日本語

BLV感染症に対するCOX-2阻害剤と抗PD-L1抗体併用法の抗ウイルス効果の検討　　　　　　　　　　　　　　　
佐治木 大和, 今内 覚, 岡川 朋弘, 前川 直也, 後藤 伸也, 小原 潤子, 山田 慎二, 加藤 幸成, 鈴木 定彦, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 381, 381, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
日本語

Mycoplasma bovis感染症に対する抗PD-L1キメラ抗体を用いた臨床試験　　　　　　　　　　　　　　　
後藤 伸也, 今内 覚, 平野 佑気, 小原 潤子, 岡川 朋弘, 前川 直也, 鈴木 定彦, 加藤 幸成, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 381, 381, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
日本語

RNA-Seqを用いたワクモ(Dermanyssus gallinae)の吸血状態別における遺伝子発現解析　　　　　　　　　　　　　　　
藤澤 宗太郎, 村田 史郎, 竹原 昌生, 伊勢崎 政美, 小川 遼, 宇野 有紀子, 種子野 章, 前川 直也, 岡川 朋弘, 今内 覚, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 412, 412, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
日本語

COX-2阻害剤の併用による抗PD-L1抗体を用いたイヌ腫瘍免疫療法の効果増強に向けた基礎的検討　　　　　　　　　　　　　　　
前川 直也, 今内 覚, 浅野 裕美恵, 岡川 朋弘, 高木 哲, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162回, 460, 460, (公社)日本獣医学会, 2019年08月
日本語

Vector transmission of bovine leukemia virus during summer season in Northern Hokkaido
Inagaki H, Konnai S, Kaburagi H, Murota H, Takabatake N, Watari K, Okagawa T, Maekawa N, Murata S, Ohashi K
Jpn. J. Vet. Res, 67, 3, 235, 239, 2019年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Haematophagous mites on poultry farms in the Republic of the Union of Myanmar　　　　　　　　　　　　　　　
Takehara M, Murata S, Katakura K, Fujisawa S, Hmoon MM, Win SY, Bawn S, Htun LL, Aung YH, Win MM, Isezaki M, Maekawa N, Okagawa T, Konnai S, Ohashi K
Heliyon, 5, 4, e01544, 2019年04月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Carbohydrate Metabolic Compensation Coupled to High Tolerance to Oxidative Stress in Ticks　　　　　　　　　　　　　　　
Noce BD, Uhl M, Machado J, Waltero C, Abreu L, Silva R, Fonseca R, Barros C, Sabadin G, Konnai S, Silva Vaz Jr. I, Ohashi K, Logullo C
Sci Rep., 9, 4753, 2019年03月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Effects of bovine tumor necrosis factor alpha decoy receptors on cell death and inflammatory cytokine kinetics: Potential for bovine inflammation therapy　　　　　　　　　　　　　　　
Fujisawa S, Konnai S, Okagawa T, Maekawa N, Tanaka A, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
BMC Vet Res., 15, 1, 68, 2019年02月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Identification of immuno-inhibitory molecules in Mongolian native cattle and yak
Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Okagawa T, Maekawa N, Murata S, Ohashi K
Jpn J Vet Res, 66, 3, 177, 192, 2018年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Cooperation of PD-1 and LAG-3 in the exhaustion of CD4+ and CD8+ T cells during bovine leukemia virus infection　　　　　　　　　　　　　　　
Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Maekawa N, Goto S, Ikebuchi R, Kohara J, Suzuki Y, Yamada S, Kato Y, Murata S, Ohashi K
Vet Res., 49, 1, 50, 2018年06月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Prostaglandin E2 Induction Suppresses the Th1 Immune Responses in Cattle with Johne's Disease　　　　　　　　　　　　　　　
Sajiki Y, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Goto S, Ikebuchi R, Nagata R, Kawaji S, Kagawa Y, Yamada S, Kato Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Mori Y, Ohashi K
Infect Immun., 86, 5, e00910-17, 2018年04月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Identification of an Atypical Enzootic Bovine Leukosis in Japan by Using a Novel Classification of Bovine Leukemia Based on Immunophenotypic Analysis
Nishimori A, Konnai S, Okagawa T, Maekawa N, Goto S, Ikebuchi R, Nakahara A, Chiba Y, Ikeda M, Murata S, Ohashi K
Clin Vaccine Immunol., 24, 12, e00001-18, American Society for Microbiology, 2018年04月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular detection and phylogenetic analysis of Ehrlichia canis in a Philippine dog
Maekawa N, Konnai S, Balbin MM, Mingala CN, Gicana KRB, Bernando FAEM, Murata S, Ohashi K
Ticks Tick Borne Dis., 9, 2, 266, 269, 2018年02月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Canine monocytic ehrlichiosis (CME), caused by a rickettsial bacterium, Ehrlichia canis, is distributed worldwide, particularly in tropical and subtropical regions. Transmission of E. canis is primarily mediated by the vector tick, Rhipicephalus sanguineus sensu lato and the bacteria then infect and replicate in monocytes and macrophages. Many cases are seen in veterinary hospitals and treated routinely; however, the genetic variation of E. canis strains found in the Philippines has been poorly investigated to date. In this study, the 16S rRNA gene and the gp200 gene of E. canis were detected by polymerase chain reaction from an infected dog in the Philippines, and the deduced amino acid sequence of the gp200 gene was subjected to a phylogenetic analysis. The Philippine genotype formed a cluster with the Taiwan genotype, and was somewhat divergent from the USA and Brazil strains. This suggested that E. canis underwent evolution in East and Southeast Asia, confirming the utility of the gp200 gene for the assessment of genetic relationships among strains.

Expression profile of Rhipicephalus microplus vitellogenin receptor during oogenesis
Seixas A, Alzugaray MF, Tirloni L, Parizi LF, Pinto AFM, Githaka NW, Konnai S, Ohashi K, Yates Iii JR, Termignoni C, da Silva Vaz I J
Ticks Tick Borne Dis., 9, 1, 72, 81, 2018年01月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Correction for Nishimori et al., "Identification of an atypical enzootic bovine leukosis in Japan by using a novel classification of bovine leukemia based on immunophenotypic analysis"(Clinical and Vaccine Immunology (2017) 24: 9 (e00067-17) DOI: 10.1128/CVI.00067-17)
Asami Nishimori, Satoru Konnai, Tomohiro Okagawa, Naoya Maekawa, Shinya Goto, Ryoyo Ikebuchi, Ayako Nakahara, Yuzumi Chiba, Masaho Ikeda, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Clinical and Vaccine Immunology, 24, 12, 2017年12月
研究論文（学術雑誌）

Molecular epidemiological survey and genetic characterization of ovine gammaherpesvirus-2 in Mongolian livestock
Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Murata S, Ohashi K
J Vet Med Sci., 79, 12, 2040, 2042, 公益社団法人 日本獣医学会, 2017年12月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）,

Sheep-associated malignant catarrhal fever (SA-MCF), caused by ovine gammaherpesvirus-2 (OvHV-2), is a fatal disease in all ruminants. The epidemiological survey and molecular characterization of OvHV-2 in Mongolian livestock were performed. Of 928 blood samples, 14 were positive for OvHV-2 in sheep and native cattle from Tsenkher County and in sheep from Lun County. Phylogenetic analyses revealed that the tegument gene of OvHV-2 sequences from Mongolian animals is identical to that in animals from Egypt, India, and Turkey, and is 98.0% similar to that in animals from Germany and Brazil. To our knowledge, this is the first confirmed report of OvHV-2 in Mongolian livestock, and could provide useful information for controlling SA-MCF.

Intrauterine infection with bovine leukemia virus in pregnant dam with high viral load
Sajiki Y, Konnai S, Nishimori A, Okagawa T, Maekawa N, Goto S, Nagano M, Kohara J, Kitano N, Takahashi T, Tajima M, Mekata H, Horii Y, Murata S, Ohashi K
J Vet Med Sci., 79, 12, 2036, 2039, 2017年12月, ［査読有り］, ［国内誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Enzootic bovine leukemia is caused by the bovine leukemia virus (BLV). BLV is transmitted vertically or horizontally through the transfer of infected cells via direct contact, through milk, insect bites and contaminated iatrogenic procedures. However, we lacked direct evidence of intrauterine infection. The purpose of this study was to confirm intrauterine BLV infection in two pregnant dams with high viral load by cesarean delivery. BLV was detected in cord and placental blood, and the BLV in the newborns showed 100% nucleotide identity with the BLV-env sequence from the dams. Notably, a newborn was seropositive for BLV but had no colostral antibodies. In this study, we presented a direct evidence of intrauterine BLV transmission in pregnant dam with a high proviral load. These results could aid the development of BLV control measures targeting viral load.

Detection and molecular characterization of equine infectious anemia virus in Mongolian horses
Sharav T, Konnai S, Ochirkhuu N, Ts EO, Mekata H, Sakoda Y, Umemura T, Murata S, Chultemdorj T, Ohashi K
J Vet Med Sci., 79, 11, 1884, 1888, 公益社団法人 日本獣医学会, 2017年11月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）,

The genetic characterization and actual prevalence of EIAV in Mongolian horse in the disease endemic region is currently unknown. Here, 11 of 776 horse serum samples from four Mongolian provinces tested positive on agar gel immunodiffusion test. Genomic DNA extracted from all seropositive samples was subjected to nested PCR assay. Among these, three samples tested positive with nested PCR assay and were identified by sequencing analysis based on long termination repeat and tat gene of the virus. Two of the three sequences were identical, with 94.0% identity with the third. These two independent Mongolian EIAV sequences were retained functional motifs, with no dramatic changes but some variability in the U5 region; they were clustered with genotypes from European countries but not with those from China, U.S.A., or Japan.

Increase of cells expressing PD-1 and PD-L1 and enhancement of IFN-γ production via PD-1/PD-L1 blockade in bovine mycoplasmosis　　　　　　　　　　　　　　　
Goto S, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Gondaira S, Higuchi H, Koiwa M, Tajima M, Kohara J, Ogasawara S, Kato Y, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Immun Inflamm Dis., 5, 3, 355, 363, 2017年09月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular Epidemiological Survey and Genetic Characterization of Anaplasma Species in Mongolian Livestock
Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Murata S, Ohashi K
Vector Borne Zoonotic Dis., 17, 8, 539, 549, 2017年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Anaplasma species are obligate intracellular rickettsial pathogens that cause great economic loss to the animal industry. Few studies on Anaplasma infections in Mongolian livestock have been conducted. This study examined the prevalence of Anaplasma marginale, Anaplasma ovis, Anaplasma phagocytophilum, and Anaplasma bovis by polymerase chain reaction assay in 928 blood samples collected from native cattle and dairy cattle (Bos taurus), yaks (Bos grunniens), sheep (Ovis aries), and goats (Capra aegagrus hircus) in four provinces of Ulaanbaatar city in Mongolia. We genetically characterized positive samples through sequencing analysis based on the heat-shock protein groEL, major surface protein 4 (msp4), and 16S rRNA genes. Only A. ovis was detected in Mongolian livestock (cattle, yaks, sheep, and goats), with 413 animals (44.5%) positive for groEL and 308 animals (33.2%) positive for msp4 genes. In the phylogenetic tree, we separated A. ovis sequences into two distinct clusters based on the groEL gene. One cluster comprised sequences derived mainly from sheep and goats, which was similar to that in A. ovis isolates from other countries. The other divergent cluster comprised sequences derived from cattle and yaks and appeared to be newly branched from that in previously published single isolates in Mongolian cattle. In addition, the msp4 gene of A. ovis using same and different samples with groEL gene of the pathogen demonstrated that all sequences derived from all animal species, except for three sequences derived from cattle and yak, were clustered together, and were identical or similar to those in isolates from other countries. We used 16S rRNA gene sequences to investigate the genetically divergent A. ovis and identified high homology of 99.3-100%. However, the sequences derived from cattle did not match those derived from sheep and goats. The results of this study on the prevalence and molecular characterization of A. ovis in Mongolian livestock can facilitate the control of infectious diseases in livestock.

A canine chimeric monoclonal antibody targeting PD-L1 and its clinical efficacy in canine oral malignant melanoma or undifferentiated sarcoma　　　　　　　　　　　　　　　
Maekawa N, Konnai S, Takagi S, Kagawa Y, Okagawa T, Nishimori A, Ikebuchi R, Izumi Y, Deguchi T, Nakajima C, Kato Y, Yamamoto K, Uemura H, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Sci Rep., 7, 1, 8951, 2017年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Anti-Bovine Programmed Death-1 Rat-Bovine Chimeric Antibody for Immunotherapy of Bovine Leukemia Virus Infection in Cattle
Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Maekawa N, Ikebuchi R, Goto S, Nakajima C, Kohara J, Ogasawara S, Kato Y, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Front Immunol., 8, 650, 650, 2017年06月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Blockade of immunoinhibitory molecules, such as programmed death-1 (PD-1)/PD-ligand 1 (PD-L1), is a promising strategy for reinvigorating exhausted T cells and preventing disease progression in a variety of chronic infections. Application of this therapeutic strategy to cattle requires bovinized chimeric antibody targeting immunoinhibitory molecules. In this study, anti-bovine PD-1 rat-bovine chimeric monoclonal antibody 5D2 (Boch5D2) was constructed with mammalian expression systems, and its biochemical function and antiviral effect were characterized in vitro and in vivo using cattle infected with bovine leukemia virus (BLV). Purified Boch5D2 was capable of detecting bovine PD-1 molecules expressed on cell membranes in flow cytometric analysis. In particular, Biacore analysis determined that the binding affinity of Boch5D2 to bovine PD-1 protein was similar to that of the original anti-bovine PD-1 rat monoclonal antibody 5D2. Boch5D2 was also capable of blocking PD-1/PD-L1 binding at the same level as 5D2. The immunomodulatory and therapeutic effects of Boch5D2 were evaluated by in vivo administration of the antibody to a BLV-infected calf. Inoculated Boch5D2 was sustained in the serum for a longer period. Boch5D2 inoculation resulted in activation of the proliferation of BLV-specific CD4+ T cells and decrease in the proviral load of BLV in the peripheral blood. This study demonstrates that Boch5D2 retains an equivalent biochemical function to that of the original antibody 5D2 and is a candidate therapeutic agent for regulating antiviral immune response in vivo. Clinical efficacy of PD-1/PD-L1 blockade awaits further experimentation with a large number of animals.

In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection
Nishimori A, Konnai S, Okagawa T, Maekawa N, Ikebuchi R, Goto S, Sajiki Y, Suzuki Y, Kohara J, Ogasawara S, Kato Y, Murata S, Ohashi K
PLoS One., 12, 4, e0174916, 2017年04月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Programmed death-1 (PD-1), an immunoinhibitory receptor on T cells, is known to be involved in immune evasion through its binding to PD-ligand 1 (PD-L1) in many chronic diseases. We previously found that PD-L1 expression was upregulated in cattle infected with bovine leukemia virus (BLV) and that an antibody that blocked the PD-1/PD-L1 interaction reactivated T-cell function in vitro. Therefore, this study assessed its antivirus activities in vivo. First, we inoculated the anti-bovine PD-L1 rat monoclonal antibody 4G12 into a BLV-infected cow. However, this did not induce T-cell proliferation or reduction of BLV provirus loads during the test period, and only bound to circulating IgM+ B cells until one week post-inoculation. We hypothesized that this lack of in vivo effects was due to its lower stability in cattle and so established an anti-PD-L1 rat-bovine chimeric antibody (Boch4G12). Boch4G12 was able to bind specifically with bovine PD-L1, interrupt the PD-1/PD-L1 interaction, and activate the immune response in both healthy and BLV-infected cattle in vitro. Therefore, we experimentally infected a healthy calf with BLV and inoculated it intravenously with 1 mg/kg of Boch4G12 once it reached the aleukemic (AL) stage. Cultivation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from the tested calf indicated that the proliferation of CD4+ T cells was increased by Boch4G12 inoculation, while BLV provirus loads were significantly reduced, clearly demonstrating that this treatment induced antivirus activities. Therefore, further studies using a large number of animals are required to support its efficacy for clinical application.

Molecular and structural characterization of novel cystatins from the taiga tick Ixodes persulcatus
Rangel CK, Parizi LF, Sabadin GA, Costa EP, Romeiro NC, Isezaki M, Githaka NW, Seixas A, Logullo C, Konnai S, Ohashi K, da Silva Vaz I J
Ticks Tick Borne Dis., 8, 3, 432, 441, 2017年03月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Increase of cells expressing PD-1 and PD-L1 and enhancement of IFN-γ production via PD-1/PD-L1 blockade in bovine mycoplasmosis.
Goto, S, Konnai, S, Okagawa, T, Nishimori, A, Maekawa, N, Gondaira, S, Higuchi, H, Koiwa, M, Tajima, M, Kohara, J, Ogasawara, S, Kato, Y, Suzuki, Y, Murata, S, Ohashi, K
Immunity, Inflammation and Disease, 10, 3, 1, 9, 2017年, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, INTRODUCTION: Bovine mycoplasma, chiefly Mycoplasma bovis, is a pathogen that causes pneumonia, mastitis, arthritis, and otitis media in cattle. This pathogen exerts immunosuppressive effects, such as the inhibition of interferon production. However, the mechanisms involved in bovine mycoplasmosis have not been fully elucidated. In this study, we investigated the role of the programmed death-1 (PD-1)/programmed death-ligand 1 (PD-L1) pathway in immunosuppression in bovine mycoplasmosis. METHODS: In the initial experiments, we used enzyme-linked immunosorbent assay to measure interferon-γ (IFN-γ) from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from cattle with mycoplasmosis. RESULTS: Expectedly, IFN-γ production significantly decreased in cattle with mycoplasmosis compared with that in clinically healthy cattle. Concomitantly, flow cytometric analysis revealed that the proportions of PD-1+ CD4+ and PD-L1+ CD14+ cells significantly increased in peripheral blood of the infected cattle. Interestingly, the number of PD-1+ CD4+ and PD-1+ CD8+ T cells were negatively correlated with IFN-γ production from PBMCs in bovine mycoplasmosis. Additionally, blockade of the PD-1/PD-L1 pathway in vitro by anti-bovine PD-1- and anti-bovine PD-L1 antibodies significantly upregulated the production of IFN-γ from anti-mycoplasma-specific cells. CONCLUSIONS: These results suggest that the PD-1/PD-L1 pathway could be involved in immune exhaustion of bovine mycoplasma-specific T cells. In conclusion, our study opens up a new perspective in the therapeutic strategy for bovine mycoplasmosis by targeting the immunoinhibitory receptor pathways.

Isolation and purification of Gallid herpesvirus 2 strains currently distributed in Japan
Machida Y, Murata S, Matsuyama-Kato A, Isezaki M, Taneno A, Sakai E, Konnai S, Ohashi K
J Vet Med Sci., 79, 1, 115, 122, 公益社団法人 日本獣医学会, 2017年01月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）,

Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2) causes malignant lymphomas in chickens (Marek's disease, MD). Although MD is controlled through vaccination efforts, field isolates of GaHV-2 have increased in virulence worldwide and even cause MD in vaccinated chickens. GaHV-2 strains are classified into four categories (mild, virulent, very virulent and very virulent +) based on the virulence exhibited in experimental infection in unvaccinated or MD-vaccinated susceptible chickens. Although MD cases are sporadically reported in Japan, the recent field strains of GaHV-2 in Japan have not been characterized. During isolation of recent field strains by using primary chicken kidney cell cultures, a method classically used for GaHV-2 isolation, vaccine strains were simultaneously isolated. Therefore, it is necessary to separate vaccine strains to characterize the virulence and pathogenicity of the GaHV-2 strains currently distributed in Japan. In this study, we prepared cell suspensions from the spleens of MD-symptomatic chickens, inoculated day-old-chicks and isolated GaHV-2 strains by primary chicken kidney cell cultures at 2−3 weeks post inoculation. The isolated strains were passaged several times on chicken embryo fibroblast cells, and PCR analysis revealed that the isolated strains were not contaminated with vaccine strains. Moreover, the contaminant vaccine strains were completely removed by the purification of plaques observed in chicken kidney cells. These procedures are necessary to isolate GaHV-2 field strains from vaccine strains in order to carry out future studies to characterize these strains and glean insights into GaHV-2 virulence and pathogenicity.

Immune exhaustion during chronic infections in cattle
Konnai S, Murata S, Ohashi K
J Vet Med Sci., 79, 1, 1, 5, Japanese Society of Veterinary Science, 2017年01月, ［査読有り］, ［招待有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

A novel mechanism of functional cooperativity regulation by thiol redox status in a dimeric inorganic pyrophosphatase　　　　　　　　　　　　　　　
Costa EP, Façanha AR, Cruz CS, Silva JN, Machado JA, Carvalho GM, Fernandes MR, Martins R, Campos E, Romeiro NC, Githaka NW, Konnai S, Ohashi K, Vaz IS Jr, Logullo C
Biochim Biophys Acta Gen Subj., 1861, 1 Pt A, 2922, 2933, 2017年01月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Cooperation of PD-1 and LAG-3 Contributes to T-Cell Exhaustion in Anaplasma marginale-Infected Cattle
Okagawa T, Konnai S, Deringer JR, Ueti MW, Scoles GA, Murata S, Ohashi K, Brown WC
Infect Immun., 84, 10, 2779, 90, 2016年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The CD4(+) T-cell response is central for the control of Anaplasma marginale infection in cattle. However, the infection induces a functional exhaustion of antigen-specific CD4(+) T cells in cattle immunized with A. marginale outer membrane proteins or purified outer membranes (OMs), which presumably facilitates the persistence of this rickettsia. In the present study, we hypothesize that T-cell exhaustion following infection is induced by the upregulation of immunoinhibitory receptors on T cells, such as programmed death 1 (PD-1) and lymphocyte activation gene 3 (LAG-3). OM-specific T-cell responses and the kinetics of PD-1-positive (PD-1(+)) LAG-3(+) exhausted T cells were monitored in A. marginale-challenged cattle previously immunized with OMs. Consistent with data from previous studies, OM-specific proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and interferon gamma (IFN-γ) production were significantly suppressed in challenged animals by 5 weeks postinfection (wpi). In addition, bacteremia and anemia also peaked in these animals at 5 wpi. Flow cytometric analysis revealed that the percentage of PD-1(+) LAG-3(+) T cells in the CD4(+), CD8(+), and γδ T-cell populations gradually increased and also peaked at 5 wpi. A large increase in the percentage of LAG-3(+) γδ T cells was also observed. Importantly, in vitro, the combined blockade of the PD-1 and LAG-3 pathways partially restored OM-specific PBMC proliferation and IFN-γ production at 5 wpi. Taken together, these results indicate that coexpression of PD-1 and LAG-3 on T cells contributes to the rapid exhaustion of A. marginale-specific T cells following infection and that these immunoinhibitory receptors regulate T-cell responses during bovine anaplasmosis.

Molecular detection and characterization of bovine viral diarrhea virus in Mongolian cattle and yaks
Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Odzaya B, Gansukh S, Murata S, Ohashi K
Arch Virol., 161, 8, 2279, 83, 2016年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is classified into two species, namely, Bovine viral diarrhea virus 1 and Bovine viral diarrhea virus 2, and affects cattle worldwide, resulting in significant economic loss. The prevalence of BVDV-1 and BVDV-2 infections and its genotypes in Mongolian animals has not been studied. In this study, we surveyed BVDV infection in dairy cattle and yaks from Bornuur and Bulgan counties by RT-PCR, and the average infection rate in the sampling sites was 15.8 % and 20.0 %, respectively. In addition, molecular features of the 5'-UTR region of the BVDV genome in Mongolian cattle and yaks were identified as belonging to the subtypes BVDV-1a and BVDV-2a, respectively. Determining the prevalence, geographical distribution, and molecular diversity of BVDV-1 and BVDV-2 in various host species in Mongolia is important for further studies and process control programs.

Immunohistochemical Analysis of PD-L1 Expression in Canine Malignant Cancers and PD-1 Expression on Lymphocytes in Canine Oral Melanoma
Maekawa N, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Ikebuchi R, Izumi Y, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Kato Y, Murata S, Ohashi K
PLoS One., 11, 6, e0157176, 2016年06月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Spontaneous cancers are common diseases in dogs. Among these, some malignant cancers such as oral melanoma, osteosarcoma, hemangiosarcoma, and mast cell tumor are often recognized as clinical problems because, despite their high frequencies, current treatments for these cancers may not always achieve satisfying outcomes. The absence of effective systemic therapies against these cancers leads researchers to investigate novel therapeutic modalities, including immunotherapy. Programmed death 1 (PD-1) is a costimulatory receptor with immunosuppressive function. When it binds its ligands, PD-ligand 1 (PD-L1) or PD-L2, PD-1 on T cells negatively regulates activating signals from the T cell receptor, resulting in the inhibition of the effector function of cytotoxic T lymphocytes. Aberrant PD-L1 expression has been reported in many human cancers and is considered an immune escape mechanism for cancers. In clinical trials, anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibodies induced tumor regression for several malignancies, including advanced melanoma, non-small cell lung carcinoma, and renal cell carcinoma. In this study, to assess the potential of the PD-1/PD-L1 axis as a novel therapeutic target for canine cancer immunotherapy, immunohistochemical analysis of PD-L1 expression in various malignant cancers of dogs was performed. Here, we show that dog oral melanoma, osteosarcoma, hemangiosarcoma, mast cell tumor, mammary adenocarcinoma, and prostate adenocarcinoma expressed PD-L1, whereas some other types of cancer did not. In addition, PD-1 was highly expressed on tumor-infiltrating lymphocytes obtained from oral melanoma, showing that lymphocytes in this cancer type might have been functionally exhausted. These results strongly encourage the clinical application of PD-1/PD-L1 inhibitors as novel therapeutic agents against these cancers in dogs.

Detection of bovine leukemia virus and identification of its genotype in Mongolian cattle
Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Nishimori A, Okagawa T, Murata S, Ohashi K
Arch Virol., 161, 4, 985, 91, 2016年04月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Epidemiological studies have indicated that bovine leukemia virus (BLV) infection is globally distributed. However, no information regarding the disease and genetic diversity of the virus in the cattle of Mongolia is currently available. In this study, the prevalence of BLV was assessed using PCR, and the genetic diversity was analyzed through DNA sequencing. Of the 517 samples tested, 20 positives were identified. Phylogenetic analysis showed that six, one, and four isolates were classified into genotype 4, 7, and 1, respectively. Most isolates were clustered with isolates from Eastern Europe and Russia. This study is the first to investigate the BLV genotype in Mongolia.

Direct polymerase chain reaction from blood and tissue samples for rapid diagnosis of bovine leukemia virus infection
Nishimori A, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Nakahara A, Murata S, Ohashi K
J Vet Med Sci., 78, 5, 791, 6, 公益社団法人 日本獣医学会, 2016年01月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine leukemia virus (BLV) infection induces bovine leukemia in cattle and causes significant financial harm to farmers and farm management. There is no effective therapy or vaccine; thus, the diagnosis and elimination of BLV-infected cattle are the most effective method to eradicate the infection. Clinical veterinarians need a simpler and more rapid method of diagnosing infection, because both nested polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR are labor intensive, time-consuming, and require specialized molecular biology techniques and expensive equipment. In this study, we describe a novel PCR method for amplifying the BLV provirus from whole blood, thus eliminating the need for DNA extraction. Although the sensitivity of PCR directly from whole blood (PCR-DB) samples as measured in bovine blood containing BLV-infected cell lines was lower than that of nested PCR, the PCR-DB technique showed high specificity and reproducibility. Among 225 clinical samples, 49 samples were positive by nested PCR, and 37 samples were positive by PCR-DB. There were no false positive samples; thus, PCR-DB sensitivity and specificity were 75.51% and 100%, respectively. However, the provirus loads of the samples detected by nested PCR and not PCR-DB were quite low. Moreover, PCR-DB also stably amplified the BLV provirus from tumor tissue samples. PCR-DB method exhibited good reproducibility and excellent specificity and is suitable for screening of thousands of cattle, thus serving as a viable alternative to nested PCR and real-time PCR.

Bovine leukemia virus reduces anti-viral cytokine activities and NK cytotoxicity by inducing TGF-β secretion from regulatory T cells
Ohira K, Nakahara A, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Ikebuchi R, Kohara J, Murata S, Ohashi K
Immun Inflamm Dis., 4, 1, 52, 63, 2016年01月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) T cells suppress excess immune responses that lead to autoimmune and/or inflammatory diseases, and maintain host immune homeostasis. However, CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) T cells reportedly contribute to disease progression by over suppressing immune responses in some chronic infections. In this study, kinetic and functional analyses of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) T cells were performed in cattle with bovine leukemia virus (BLV) infections, which have reported immunosuppressive characteristics. In initial experiments, production of the Th1 cytokines IFN-γ and TNF-α was reduced in BLV-infected cattle compared with uninfected cattle, and numbers of IFN-γ or TNF-α producing CD4(+) T cells decreased with disease progression. In contrast, IFN-γ production by NK cells was inversely correlated with BLV proviral loads in infected cattle. Additionally, during persistent lymphocytosis disease stages, NK cytotoxicity was depressed as indicated by low expression of the cytolytic protein perforin. Concomitantly, total CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) T cell numbers and percentages of TGF-β(+) cells were increased, suggesting that TGF-β plays a role in the functional declines of CD4(+) T cells and NK cells. In further experiments, recombinant bovine TGF-β suppressed IFN-γ and TNF-α production by CD4(+) T cells and NK cytotoxicity in cultured cells. These data suggest that TGF-β from CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) T cells is immunosuppressive and contributes to disease progression and the development of opportunistic infections during BLV infection.

Identification and the preliminary in vitro characterization of IRIS homologue from salivary glands of Ixodes persulcatus Schulze
Toyomane K, Konnai S, Niwa A, Githaka WN, Isezaki M, Yamada S, Ito T, Takano A, Ando S, Kawabata H, Murata S, Ohashi K
Ticks and Tick-borne Diseases, 7, 1, 119, 125, 2016年, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Ixodes ricinus immunosuppressor (Iris) is a tick salivary gland protein derived from I. ricinus. In this study, Iris homolog was identified in the salivary glands of Ixodes persulcatus, which is the specific vector of the Lyme disease agent in Japan. The homolog was named Ipis-1. To investigate the function of Ipis-1, we prepared a recombinant Ipis-1 expressed in COS-7 cells as a rabbit IgG Fc-fused protein (Ipis-1-Ig). Cell proliferation assay and IFN-γ ELISA showed that Ipis-1-Ig inhibits the proliferation and IFN-γ production of bovine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Notably, Ipis-1-Ig inhibited the cell proliferation and production of IFN-γ in bovine PBMCs even when CD14(+) cells were depleted, suggesting that Ipis could directly interact with T cells and inhibit their functions. In conclusion, Ipis could contribute to the establishment of environments suitable for tick blood feeding and pathogen transmission by suppressing the function of immune cells.

A preliminary survey of the seroprevalence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Mongolian cattle
Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Murata S, Ohashi K
Jpn J Vet Res., 63, 4, 191, 4, Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University, 2015年11月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Johne's disease is a chronic infection with Mycobacterium avium susp. paratuberculosis (MAP), which causes huge economic losses to cattle industry. The seroprevalence of MAP in cattle of Mongolian was estimated by an ELISA assay using 356 serum samples which were collected from eleven provinces and Ulaanbaatar city. Out of these samples, 3 (0.84%) were found to be seropositive for MAP, originating from Tsenkher sum of Arkhangai province, Murun sum of Khuvsgul province, and Bornuur sum of Tuv province in Mongolia. This study represents first conformation of Johne's disease in Mongolian cattle. These findings provide vital information that can be used for the planning and execution of control measures for Johne's disease in the Mongolian cattle industry.

Bovine Immunoinhibitory Receptors Contribute to Suppression of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-Specific T-Cell Responses　　　　　　　　　　　　　　　
Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y, Ohashi K
Infect Immun., 84, 1, 77, 89, 2015年10月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular epidemiological survey and genetic analysis of vector-borne infections of cattle in Luzon Island, the Philippines
Ochirkhuu N, Konnai S, Mingala CN, Okagawa T, Villanueva M, Pilapil FM, Murata S, Ohashi K
Vet Parasitol., 212, 3-4, 161, 7, 2015年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, In the Philippines, vector-borne disease is one of the important problems in the livestock industry. To elucidate the epidemiology of vector-borne diseases in cattle on Luzon Island, the Philippines, the prevalence of five protozoan agents was assessed by polymerase chain reaction. Out of the 339 samples, 324 (95.5%), 154 (45.4%), 209 (61.6%), 140 (41.3%), and 2 (0.6%) were positive for Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis, Theileria spp., and Trypanosoma evansi infections, respectively. Mixed infections were detected in 290 (85.5%) samples, of which 115 (33.9%) had two pathogens, 144 (42.5%) had three pathogens, and 31 (9.1%) had four kinds of pathogens. 16S rRNA gene was 100% identical in A. marginale compared with the same lineage across the world. B. bovis RAP-1 and B. bigemina AMA-1 genes were identical with 92.27%-100% and 97.07%-100% sequences, respectively, in the database (Asian isolates). MPSP genes of Theileria spp. were 83.51%-100% identical with the one another. Phylogenetic analysis showed that they belong to the groups of T. sergenti and T. buffeli. Positive rates of the tick-borne pathogens were extremely high in this area. These findings provide vital information that can be used for the planning and execution of effective control measures for vector-borne diseases in the Philippine cattle industry.

Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi
Mekata H, Murata S, Mingala CN, Ohashi K, Konnai S
J Vet Med Sci., 77, 8, 1017, 9, 2015年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Vaccination with cyclin-dependent kinase tick antigen confers protection against Ixodes infestation
Gomes H, Moraes J, Githaka N, Martins R, Isezaki M, Vaz Ida S Jr, Logullo C, Konnai S, Ohashi K
Vet Parasitol., 211, 3-4, 266, 73, 2015年07月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Increased expression of the regulatory T cell-associated marker CTLA-4 in bovine leukemia virus infection
Suzuki S, Konnai S, Okagawa T, Ikebuchi R, Nishimori A, Kohara J, Mingala CN, Murata S, Ohashi K
Vet Immunol Immunopathol., 163, 3-4, 115, 24, 2015年02月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Regulatory T cells (Tregs) play a critical role in the maintenance of the host's immune system. Tregs, particularly CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells, have been reported to be involved in the immune evasion mechanism of tumors and several pathogens that cause chronic infections. Recent studies showed that a Treg-associated marker, cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), is closely associated with the progression of several diseases. We recently reported that the proportion of Foxp3(+)CD4(+) cells was positively correlated with the number of lymphocytes, virus titer, and virus load but inversely correlated with IFN-γ expression in cattle infected with bovine leukemia virus (BLV), which causes chronic infection and lymphoma in its host. Here the kinetics of CTLA-4(+) cells were analyzed in BLV-infected cattle. CTLA-4 mRNA was predominantly expressed in CD4(+) T cells in BLV-infected cattle, and the expression was positively correlated with Foxp3 mRNA expression. To test for differences in the protein expression level of CTLA-4, we measured the proportion of CTLA-4-expressing cells by flow cytometry. In cattle with persistent lymphocytosis (PL), mean fluorescence intensities (MFIs) of CTLA-4 on CD4(+) and CD25(+) T cells were significantly increased compared with that in control and aleukemic (AL) cattle. The percentage of CTLA-4(+) cells in the CD4(+) T cell subpopulation was positively correlated with TGF-β mRNA expression, suggesting that CD4(+)CTLA-4(+) T cells have a potentially immunosuppressive function in BLV infection. In the limited number of cattle that were tested, the anti-CTLA-4 antibody enhanced the expression of CD69, IL-2, and IFN-γ mRNA in anti-programmed death ligand 1 (PD-L1) antibody-treated peripheral blood mononuclear cells from BLV-infected cattle. Together with previous findings, the present results indicate that Tregs may be involved in the inhibition of T cell function during BLV infection.

Rhipicephalus microplus and Ixodes ovatus cystatins in tick blood digestion and evasion of host immune response
Parizi LF, Sabadin GA, Alzugaray MF, Seixas A, Logullo C, Konnai S, Ohashi K, Masuda A, da Silva Vaz I J
Parasit Vectors., 8, 122, 2015年02月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Non-classical gluconeogenesis-dependent glucose metabolism in Rhipicephalus microplus embryonic cell line BME26
da Silva RM, Noce BD, Waltero CF, Costa EP, de Abreu LA, Githaka NW, Moraes J, Gomes HF, Konnai S, Vaz Ida S Jr, Ohashi K, Logullo C
Int J Mol Sci., 16, 1, 1821, 39, 2015年01月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

An investigation of binding ability of Ixodes persulcatus Schulze Salp15 with Lyme disease spirochetes.
Murase Y, Konnai S, Yamada S, Githaka N, Isezaki M, Ito T, Takano A, Ando S, Kawabata H, Murata S, Ohashi K
Insect Biochemistry and Molecular Biology, 60, 59, 67, 2015年, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Influence of PD-L1 cross-linking on cell death in PD-L1-expressing cell lines and bovine lymphocytes
Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Immunology, 142, 4, 551, 61, 2014年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Programmed death-ligand 1 (PD-L1) blockade is accepted as a novel strategy for the reactivation of exhausted T cells that express programmed death-1 (PD-1). However, the mechanism of PD-L1-mediated inhibitory signalling after PD-L1 cross-linking by anti-PD-L1 monoclonal antibody (mAb) or PD-1-immunogloblin fusion protein (PD-1-Ig) is still unknown, although it may induce cell death of PD-L1(+) cells required for regular immune reactions. In this study, PD-1-Ig or anti-PD-L1 mAb treatment was tested in cell lines that expressed PD-L1 and bovine lymphocytes to investigate whether the treatment induces immune reactivation or PD-L1-mediated cell death. PD-L1 cross-linking by PD-1-Ig or anti-PD-L1 mAb primarily increased the number of dead cells in PD-L1(high) cells, but not in PD-L1(low) cells; these cells were prepared from Cos-7 cells in which bovine PD-L1 expression was induced by transfection. The PD-L1-mediated cell death also occurred in Cos-7 and HeLa cells transfected with vectors only encoding the extracellular region of PD-L1. In bovine lymphocytes, the anti-PD-L1 mAb treatment up-regulated interferon-γ (IFN-γ) production, whereas PD-1-Ig treatment decreased this cytokine production and cell proliferation. The IFN-γ production in B-cell-depleted peripheral blood mononuclear cells was not reduced by PD-1-Ig treatment and the percentages of dead cells in PD-L1(+) B cells were increased by PD-1-Ig treatment, indicating that PD-1-Ig-induced immunosuppression in bovine lymphocytes could be caused by PD-L1-mediated B-cell death. This study provides novel information for the understanding of signalling through PD-L1.

Expression analysis of programmed death ligand 2 in tumors caused by the avian oncovirus Marek's disease virus
Matsuyama-Kato A, Murata S, Isezaki M, Takasaki S, Kano R, Konnai S, Ohashi K
Arch Virol., 159, 8, 2123, 6, 2014年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, PD-L2 is a ligand of the immunoinhibitory receptor PD-1. Here, we report functional and expression analyses of PD-L2 in tumor lesions and spleens from chickens infected with gallid herpesvirus 2 (GaHV-2, Marek's disease virus), which induces malignant lymphomas in chickens. We show that the expression of IFN-γ protein was decreased in PBMCs and splenocytes co-cultured with PD-L2-expressing cells and that the expression of PD-L2 mRNA was significantly higher in the spleens of infected chickens in the latent phase and in tumor lesions caused by GaHV-2. These results suggest that chicken PD-L2 has an immunoinhibitory function and is involved in the establishment of latency and tumor formation by GaHV-2.

Reprolysin metalloproteases from Ixodes persulcatus, Rhipicephalus sanguineus and Rhipicephalus microplus ticks
Ali A, Tirloni L, Isezaki M, Seixas A, Konnai S, Ohashi K, da Silva Vaz, Junior I, Termignoni C
Exp Appl Acarol., 63, 4, 559, 78, 2014年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Differences in cellular function and viral protein expression between IgMhigh and IgMlow B-cells in bovine leukemia virus-infected cattle
Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Nakahara A, Murata S, Ohashi K
J Gen Virol., 95, Pt 8, 1832, 42, 2014年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Bovine leukemia virus (BLV) induces abnormal B-cell proliferation and B-cell lymphoma in cattle, where the BLV provirus is integrated into the host genome. BLV-infected B-cells rarely express viral proteins in vivo, but short-term cultivation augments BLV expression in some, but not all, BLV-infected B-cells. This observation suggests that two subsets, i.e. BLV-silencing cells and BLV-expressing cells, are present among BLV-infected B-cells, although the mechanisms of viral expression have not been determined. In this study, we examined B-cell markers and viral antigen expression in B-cells from BLV-infected cattle to identify markers that may discriminate BLV-expressing cells from BLV-silencing cells. The proportions of IgM(high) B-cells were increased in blood lymphocytes from BLV-infected cattle. IgM(high) B-cells mainly expressed BLV antigens, whereas IgM(low) B-cells did not, although the provirus load was equivalent in both subsets. Several parameters were investigated in these two subsets to characterize their cellular behaviour. Real-time PCR and microarray analyses detected higher expression levels of some proto-oncogenes (e.g. Maf, Jun and Fos) in IgM(low) B-cells than those in IgM(high) B-cells. Moreover, lymphoma cells obtained from the lymph nodes of 14 BLV-infected cattle contained IgM(low) or IgM(-) B-cells but no IgM(high) B-cells. To our knowledge, this is the first study to demonstrate that IgM(high) B-cells mainly comprise BLV-expressing cells, whereas IgM(low) B-cells comprise a high proportion of BLV-silencing B-cells in BLV-infected cattle.

Tick Surveillance for Relapsing Fever Spirochete Borrelia miyamotoi in Hokkaido, Japan
Takano, Ai, Toyomane, Kochi, Konnai, Satoru, Ohashi, Kazuhiko, Nakao, Minoru, Ito, Takuya, Andoh, Masako, Maeda, Ken, Watarai, Masahisa, Sato, Kozue, Kawabata, Hiroki
PLOS ONE, 9, 8, e104532, 2014年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Identification and characterization of bovine programmed death-ligand 2
Nishimori A, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Nakajima C, Suzuki Y, Mingala CN, Murata S, Ohashi K
Microbiol Immunol., 58, 7, :388, 97, 2014年07月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Previous reports from this group have indicated that the immunoinhibitory programmed death (PD)-1 receptor and its ligand, PD-L1, are involved in the mechanism of immune evasion of bovine chronic infection. However, no functional analysis of bovine PD-L2 in cattle has been reported. Thus, in this study, the molecular function of bovine PD-L2 was analyzed in vitro. Recombinant PD-L2 (PD-L2-Ig), which comprises an extracellular domain of bovine PD-L2 fused to the Fc portion of rabbit IgG1, was prepared based on the cloned cDNA sequence for bovine PD-L2. Bovine PD-L2-Ig bound to bovine PD-1-expressing cells and addition of soluble bovine PD-1-Ig clearly inhibited the binding of PD-L2-Ig to membrane PD-1 in a dose-dependent manner. Cell proliferation and IFN-γ production were significantly enhanced in the presence of PD-L2-Ig in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from cattle. Moreover, PD-L2-Ig significantly enhanced IFN-γ production from virus envelope peptides-stimulated PBMCs derived from bovine leukemia virus-infected cattle. Interestingly, PD-L2-Ig-induced IFN-γ production was further enhanced by treatment with anti-bovine PD-1 antibody. These data suggest potential applications of bovine PD-L2-Ig as a therapy for bovine diseases.

Expression of PD-L1 on canine tumor cells and enhancement of IFN-γ production from tumor-infiltrating cells by PD-L1 blockade
Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
PLoS One., 9, 6, e98415, 2014年06月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Programmed death 1 (PD-1), an immunoinhibitory receptor, and programmed death ligand 1 (PD-L1), its ligand, together induce the "exhausted" status in antigen-specific lymphocytes and are thus involved in the immune evasion of tumor cells. In this study, canine PD-1 and PD-L1 were molecularly characterized, and their potential as therapeutic targets for canine tumors was discussed. The canine PD-1 and PD-L1 genes were conserved among canine breeds. Based on the sequence information obtained, the recombinant canine PD-1 and PD-L1 proteins were constructed; they were confirmed to bind each other. Antibovine PD-L1 monoclonal antibody effectively blocked the binding of recombinant PD-1 with PD-L1-expressing cells in a dose-dependent manner. Canine melanoma, mastocytoma, renal cell carcinoma, and other types of tumors examined expressed PD-L1, whereas some did not. Interestingly, anti-PD-L1 antibody treatment enhanced IFN-γ production from tumor-infiltrating cells. These results showed that the canine PD-1/PD-L1 pathway is also associated with T-cell exhaustion in canine tumors and that its blockade with antibody could be a new therapeutic strategy for canine tumors. Further investigations are needed to confirm the ability of anti-PD-L1 antibody to reactivate canine antitumor immunity in vivo, and its therapeutic potential has to be further discussed.

Identification and sequence characterization of novel Theileria genotypes from the waterbuck (Kobus defassa) in a Theileria parva-endemic area in Kenya
Githaka N, Konnai S, Bishop R, Odongo D, Lekolool I, Kariuki E, Gakuya F, Kamau L, Isezaki M, Murata S, Ohashi K
Vet Parasitol., 202, 3-4, 180, 93, 2014年03月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Waterbuck (Kobus defassa), an ungulate species endemic to the Eastern African savannah, is suspected of being a wildlife reservoir for tick-transmitted parasites infective to livestock. Waterbuck is infested by large numbers of Rhipicephalus appendiculatus, the tick vector for Theileria parva, and previous data suggests that the species may be a source of T. parva transmission to cattle. In the present study, a total of 86 cattle and 26 waterbuck blood samples were obtained from Marula, a site in Kenya endemic for East Coast fever (ECF) where the primary wildlife reservoir of T. parva the Cape buffalo (Syncerus caffer) is also common. To investigate for the presence of cattle-infective Theileria parasites, DNA specimens extracted from the blood samples were subjected to two diagnostic assays; a nested PCR based on the p104 gene that is specific for T. parva, and a reverse line blot (RLB) incorporating 13 oligonucleotide probes including all of the Theileria spp. so far described from livestock and wildlife in Kenya. Neither assay provided evidence of T. parva or Theileria sp. (buffalo) infection in the waterbuck DNA samples. By contrast, majority of the cattle samples (67.4%) were positive for T. parva using a nested PCR assay. The RLB assay, including a generic probe for the genus Theileria, indicated that 25/26 (96%) of the waterbuck samples were positive for Theileria, while none of the 11 Theileria species-specific probes hybridized with the waterbuck-derived PCR products. Phylogenetic analysis of 18S ribosomal RNA (18S rRNA) and internal transcribed spacer (ITS) sequences within the RLB-positive waterbuck samples revealed the occurrence of three Theileria genotypes of unknown identity designated A, B and C. Group A clustered with Theileria equi, a pathogenic Theileria species and a causative agent of equine piroplasmosis in domestic equids. However, DNA from this group failed to hybridize with the T. equi oligonucleotide present on the RLB filter probe, suggesting the occurrence of novel taxa in these animals. This was confirmed by DNA sequencing that revealed heterogeneity between the waterbuck isolates and previously reported T. equi genotypes. Group B parasites clustered closely with Theileria luwenshuni, a highly pathogenic parasite of sheep and goats reported from China. Group C was closely related to Theileria ovis, an apparently benign parasite of sheep. Together, these findings provided no evidence that waterbuck plays a role in the transmission of T. parva. However, novel Theileria genotypes detected in this bovid species may be of veterinary importance.

Suppressive effects of neutrophil by Salp16-like salivary gland proteins from Ixodes persulcatus Schulze tick
Hidano A, Konnai S, Yamada S, Githaka N, Isezaki M, Higuchi H, Nagahata H, Ito T, Takano A, Ando S, Kawabata H, Murata S, Ohashi K
Insect Molecular Biology, 23, 4, 466, 474, 2014年, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Sequence characterization and immunogenicity of cystatins from the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Parizi LF, Githaka NW, Acevedo C, Benavides U, Seixas A, Logullo C, Konnai S, Ohashi K, Masuda A, da Silva Vaz I J
Ticks Tick Borne Dis., 4, 6, 492, 9, 2013年12月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Horizontal transmission of bovine leukemia virus from lymphocytotic cattle, and beneficial effects of insect vector control
Ooshiro M, Konnai S, Katagiri Y, Afuso M, Arakaki N, Tsuha O, Murata S, Ohashi K
Vet Rec., 173, 21, 527, 2013年11月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Genotypic variations in field isolates of Theileria species infecting giraffes (Giraffa camelopardalis tippelskirchi and Giraffa camelopardalis reticulata) in Kenya
Githaka N, Konnai S, Skilton R, Kariuki E, Kanduma E, Murata S, Ohashi K
Parasitol Int., 62, 5, 448, 53, 2013年10月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Recently, mortalities among giraffes, attributed to infection with unique species of piroplasms were reported in South Africa. Although haemoparasites are known to occur in giraffes of Kenya, the prevalence, genetic diversity and pathogenicity of these parasites have not been investigated. In this study, blood samples from 13 giraffes in Kenya were investigated microscopically and genomic DNA extracted. PCR amplicons of the hyper-variable region 4 (V4) of Theileria spp. small subunit ribosomal RNA (18S rRNA) gene were hybridized to a panel of genus- and species-specific oligonucleotide probes by reverse line blot (RLB). Two newly designed oligonucleotide probes specific for previously identified Theileria spp. of giraffes found single infections in eight of the specimens and mixed infections in the remaining five samples. Partial 18S rRNA genes were successfully amplified from 9 samples and the PCR amplicons were cloned. A total of 28 plasmid clones representing the Kenyan isolates were analyzed in the present study and compared with those of closely-related organisms retrieved from GenBank. In agreement with RLB results, the nucleotide sequence alignment indicated the presence of mixed infections in the giraffes. In addition, sequence alignment with the obtained 18S rRNA gene sequences revealed extensive microheterogeneities within and between isolates, characterized by indels in the V4 regions and point mutations outside this region. Phylogeny with 18S rRNA gene sequences from the detected parasites and those of related organisms places Theileria of giraffes into two major groups, within which are numerous clades that include the isolates reported in South Africa. Collectively, these data suggest the existence of at least two distinct Theileria species among giraffes, and extensive genetic diversity within the two parasite groups.

Identification and structural-functional analysis of cyclin-dependent kinases of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Gomes H, Romeiro NC, Braz GR, de Oliveira EA, Rodrigues C, da Fonseca RN, Githaka N, Isezaki M, Konnai S, Ohashi K, da Silva Vaz I Jr, Logullo C, Moraes J
PLoS One., 8, 10, e76128., 2013年10月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Expression analysis of Foxp3 in T cells from bovine leukemia virus infected cattle
Suzuki S, Konnai S, Okagawa T, Ikebuchi R, Shirai T, Sunden Y, Mingala CN, Murata S, Ohashi K
Microbiol Immunol., 57, 8, 600, 4, 2013年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, In the present study, we monitored Foxp3(+) T cells in bovine leukemia virus (BLV)-infected cattle. By flow cytometric analysis, the proportion of Foxp3(+) CD4(+) cells from persistent lymphocytotic cattle was significantly increased compared to control and AL cattle. Interestingly, the proportion of Foxp3(+) CD4(+) cells correlated positively with the increased number of lymphocytes, virus titer and virus load, whereas it inversely correlated with IFN-γ mRNA expression, suggesting that Foxp3(+) CD4(+) T cells in cattle have a potentially immunosuppressive function. Further studies are necessary to elucidate the detailed mechanism behind the increased Treg during BLV infection.

Blockade of bovine PD-1 increases T cell function and inhibits bovine leukemia virus expression in B cells in vitro.
Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K
Vet Res., 44, 1, 59, 59, 2013年07月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Programmed death-1 (PD-1) is a known immunoinhibitory receptor that contributes to immune evasion of various tumor cells and pathogens causing chronic infection, such as bovine leukemia virus (BLV) infection. First, in this study, to establish a method for the expression and functional analysis of bovine PD-1, hybridomas producing monoclonal antibodies (mAb) specific for bovine PD-1 were established. Treatment with these anti-PD-1 mAb enhanced interferon-gamma (IFN-γ) production of bovine peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Next, to examine whether PD-1 blockade by anti-PD-1 mAb could upregulate the immune reaction during chronic infection, the expression and functional analysis of PD-1 in PBMC isolated from BLV-infected cattle with or without lymphoma were performed using anti-PD-1 mAb. The frequencies of both PD-1+ CD4+ T cells in blood and lymph node and PD-1+ CD8+ T cells in lymph node were higher in BLV-infected cattle with lymphoma than those without lymphoma or control uninfected cattle. PD-1 blockade enhanced IFN-γ production and proliferation and reduced BLV-gp51 expression and B-cell activation in PBMC from BLV-infected cattle in response to BLV-gp51 peptide mixture. These data show that anti-bovine PD-1 mAb could provide a new therapy to control BLV infection via upregulation of immune response.

Expression analysis of Foxp3 in T-cells from bovine leukemia virus infected cattle.
Suzuki S, Konnai S, Okagawa T, Ikebuchi R, Shirai T, Sunden Y, Mingala CN, Murata S, Ohashi K
Microbiology and immunology, 2013年06月, ［査読有り］

Characterization of Meq proteins from field isolates of Marek's disease virus in Japan
Murata S, Hashiguchi T, Hayashi Y, Yamamoto Y, Matsuyama-Kato A, Takasaki S, Isezaki M, Onuma M, Konnai S, Ohashi K
Infect Genet Evol., 16, 137, 43, Elsevier Science Bv, 2013年06月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Serotype 1 strains of Marek's disease virus (MDV-1) cause malignant lymphomas in chickens (Marek's disease; MD). Although MD has been controlled by vaccination, field isolates of MDV-1 have tended to increase in virulence and cause MD even in vaccinated chickens. Meq, a putative MDV-1 oncoprotein, resembles the Jun/Fos family of basic leucine zipper (bZIP) transcription factors and can regulate the expression of viral and cellular genes as a homodimer or as a heterodimer with a variety of bZIP family proteins. Sequencing analysis of some of the viral genes of various MDV-1 strains revealed a distinct diversity of and point mutations in Meq, which may contribute to changes in the transcriptional activities of Meq and, consequently, to increases in MDV-1 oncogenicity. However, few reports have characterized MDV-1 strains isolated in Japan. In this study, we established the amino acid sequences of MDV-1 field isolates from Japan in order to determine whether they display a distinct diversity of and point mutations in Meq. In addition, we analyzed the transactivation activities of the Meq proteins in order to evaluate whether the observed mutations affect their functions. Japanese MDV-1 isolates displayed the distinct mutations in basic region 2 (BR2) and proline-rich repeats (PRRs) of the Meq proteins as well as some unique mutations. Reporter assays revealed that the amino acid substitutions in BR2 and the PRRs affected the Meq transactivation activity. These results suggest that the distinct mutations are also present in the Meq proteins of MDV-1 isolates from Japan and affect their transactivation activities. (C) 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.

免疫抑制受容体PD-1のリガンドPD-L2の機能的特徴と臨床応用研究　　　　　　　　　　　　　　　
西森朝美, 今内 覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦
動物用ワクチンーバイオ医薬品研究会ニュースレター, 7, 19, 20, 2013年06月, ［招待有り］
日本語

Bovine whole-blood culture as a tool for the measurement of endotoxin activities in Gram-negative bacterial vaccines
Imamura S, Nakamizo M, Kawanishi M, Nakajima N, Yamamoto K, Uchiyama M, Hirano F, Nagai H, Kijima M, Ikebuchi R, Mekata H, Murata S, Konnai S, Ohashi K
Vet Immunol Immunopathol., 153, 1-2, 153, 8, 2013年05月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates
Mekata H, Konnai S, Mingala CN, Abes NS, Gutierrez CA, Dargantes AP, Witola WH, Inoue N, Onuma M, Murata S, Ohashi K
Parasitol Res., 112, 4, 1513, 21, 2013年04月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

The conserved role of the AKT/GSK3 axis in cell survival and glycogen metabolism in Rhipicephalus (Boophilus) microplus embryo tick cell line BME26
de Abreu LA, Calixto C, Waltero CF, Della Noce BP, Githaka NW, Seixas A, Parizi LF, Konnai S, Vaz Ida S, Ohashi K, Logullo C
Biochim Biophys Acta., 1830, 3, 2574, 82, 2013年03月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Identification and partial characterization of a gut Rhipicephalus appendiculatus cystatin
Imamura S, Konnai S, Yamada S, Parizi LF, Githaka N, Vaz Ida S Jr, Murata S, Ohashi K
Ticks Tick Borne Dis., 4, 1-2, 138, 44, 2013年02月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Vaccines are among the alternative tick control methods expected to replace at least in part the volumes of chemical acaricides currently used worldwide. However, a vaccination approach depends on a host immune response against proteins that are essential to tick physiology. The cystatin family is a protein class recently investigated to compose an effective antigen in a tick vaccine. In this study, a cDNA from Rhipicephalus appendiculatus with high sequence similarity to cystatins type 2 was identified by random sequencing analysis and called R. appendiculatus cystatin 1 (Ra-cyst-1). DNA sequence analysis showed that the cloned Ra-cyst-1 has a 423-bp open reading frame and codified to a 140-amino acid polypeptide. The putative mature protein consists of 115 amino acid residues with a deduced molecular weight of 12.8kDa. The highly conserved G (P-I), QxVxG (P-II), and PW (P-III) type 2 cystatins motifs are present in Ra-cyst-1 cDNA. RT-PCR analysis showed that the Ra-cyst-1 gene is expressed in nymph, male, and female midgut following blood feeding, but not in the salivary glands of fed females. In addition, Western blot revealed that recombinant Ra-cyst-1 was not recognized by sera derived from rabbits infested with ticks, suggesting that this cystatin is not secreted into the host during infestation. We hypothesize that Ra-cyst-1 may play a role in the tick feeding process and could be a concealed antigen candidate in further anti-tick vaccination trials.

Enhanced expression of LAG-3 on lymphocyte subpopulations from persistently lymphocytotic cattle infected with bovine leukemia virus
Konnai S, Suzuki S, Shirai T, Ikebuchi R, Okagawa T, Sunden Y, Mingala CN, Onuma M, Murata S, Ohashi K
Comp Immunol Microbiol Infect Dis., 36, 1, 63, 9, 2013年01月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, An immunoinhibitory receptor, lymphocyte activation gene-3 (LAG-3), which is mainly expressed in T-cells, is involved in the immune evasion of several pathogens causing chronic infections and tumors. However, unlike human or mouse LAG-3, no functional analysis of LAG-3 has been reported in domestic animals. Thus, in this study, bovine LAG-3 expression was analyzed in bovine leukemia virus (BLV)-infected cattle. In persistent lymphocytotic (PL) cattle, the numbers of LAG-3(+)CD4(+) cells and LAG-3(+)CD8(+) cells were conserved whilst the number of MHC class II(+) cells was remarkably higher than in the control animals. In contrast, the mean fluorescence intensity (MFI) for LAG-3 on PBMCs from PL cattle was significantly increased compared to control and asymptomatic (AL) cattle. Specifically, the LAG-3 expression level was significantly increased in both CD4(+) and CD8(+) T cells from PL cattle. LAG-3 expression correlated positively with increased numbers of lymphocytes and MHC class II(+) cells in infected animals. Preliminary results from PD-L1 and LAG-3 blockade assay revealed that IFN-γ and IL-2 expressions were significantly up-regulated by addition of anti- PD-L1 and LAG-3 antibodies in PBMCs from PL cattle. These findings suggest that LAG-3 might be involved in the inhibition of T-cell function through its binding and signaling on MHC class II molecule during BLV infection.

Prevalence of Lyme borrelia in Ixodes persulcatus ticks from an area with a confirmed case of Lyme disease.
Murase Y, Konnai S, Githaka N, Hideno A, Taylor K, Ito T, Takano A, Ando S, Kawabata H, Tsubota T, Murata S, Ohashi K
Journal of Veterinary Medical Science, 75, 2, 215, 218, JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE, 2013年, ［査読有り］
英語, In this study, the prevalence of Borrelia infections in Ixodes ticks from a site in Hokkaido, Japan, with confirmed cases of Lyme disease was determined by a PCR method capable of detecting and differentiating between strains of pathogenic Borrelia, with particular emphasis on Borrelia garinii (B. garinii) and Borrelia afzelli (B. afzelli), using tick-derived DNA extracts as template. A total of 338 ticks, inclusive of 284 Ixodes persulcatus (I. persulcatus), were collected by flagging vegetation in mid-spring. Ninety-eight (34.5%) of I. persulcatus tested positive for Borrelia species DNA, whereas the overall prevalence of Borrelia species in Ixodes ovatus and Haemaphysalis longicornis ticks was 19.5 and 7.7%, respectively. PCR-RFLP and sequence analysis of Borrelia rrf(5S)-rrl(23S) intergenic spacer DNA amplicons indicated that they originated from three different Borrelia species namely, B. garinii, B. afzelii and B. japonica. Among the I. persulcatus species, which is a known vector of human borreliosis, 86 were mono-infected with B. garinii, 2 ticks were mono-infected with B. afzelii and whereas 12 ticks had dual infections. Most significant, 11 of the I. persulcatus ticks were coinfected with Anaplasma phagocytophilum and B. garinii. The difference between the number of obtained and expected co-infections was significant (χ²=4.32, P=0.038).

The quest for a universal vaccine against ticks: cross-immunity insights
Parizi LF, Githaka NW, Logullo C, Konnai S, Masuda A, Ohashi K, da Silva Vaz I J
Vet J., 194, 2, 158, 65, 2012年11月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular detection and characterization of potentially new Babesia and Theileria species/variants in wild felids from Kenya
Githaka N, Konnai S, Kariuki E, Kanduma E, Murata S, Ohashi K
Acta Trop., 124, 1, 71, 8, 2012年10月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Piroplasms frequently infect domestic and wild carnivores. At present, there is limited information on the occurrence and molecular identity of these tick-borne parasites in wild felids in Kenya. In 2009, a pair of captive lions (Panthare leo) was diagnosed with suspected babesiosis and mineral deficiency at an animal orphanage on the outskirts of Nairobi, Kenya. Blood smears indicated presences of haemoparasites in the erythrocytes, however, no further investigations were conducted to identify the infecting agent. The animals recovered completely following diet supplementation and treatment with anti-parasite drug. In this report, we extracted and detected parasite DNA from the two lions and seven other asymptomatic feline samples; two leopards (Panthera pardus) and five cheetahs (Acinonyx jubatus). Reverse line blot with probes specific for Babesia spp. of felines indicated the presence of new Babesia species or genotypes in the lions and leopards, and unknown Theileria sp. in the cheetahs. Phylogenetic analyses using partial sequences of 18S ribosomal RNA (18S rRNA) gene showed that the parasite infecting the lions belong to the Babesia canis complex, and the parasite variant detected in the leopards clusters in a clade bearing other Babesia spp. reported in wild felids from Africa. The cheetah isolates falls in the Theileria sensu stricto group. Our findings indicate the occurrence of potentially new species or genotypes of piroplams in all three feline species.

Transcriptional profiling of inflammatory cytokine genes in African buffaloes (Syncerus caffer) infected with Theileria parva
Okagawa T, Konnai S, Mekata H, Githaka N, Suzuki S, Kariuki E, Gakuya F, Kanduma E, Shirai T, Ikebuchi R, Ikenaka Y, Ishizuka M, Murata S, Ohashi K
Vet Immunol Immunopathol., 148, 3-4, 373, 9, 2012年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Surveillance of Marek's disease virus in migratory and sedentary birds in Hokkaido, Japan
Murata S, Hayashi Y, Kato A, Isezaki M, Takasaki S, Onuma M, Osa Y, Asakawa M, Konnai S, Ohashi K
Vet J., 192, 3, 538, 40, Elsevier, 2012年06月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Marek's disease virus serotype 1 (MDV-1) strains cause malignant lymphoma in chickens. MDV-1 has been previously reported to be widespread in white-fronted geese (Anser albifrons); however, the prevalence of MDV-1 in other wild birds has not been determined. In this study, we investigated the prevalence of MDV-1 in various wild birds in Hokkaido, Japan. The MDV-1 genome was widespread in geese and ducks, but was not detected in other birds. MDV-1 was detected in both sedentary and migratory species. These results suggest that, in Japan. MDV-1 is widespread in wild goose and duck populations, and that resident ducks may be significant carriers and reservoirs of MDV-1.

Kinetics of regulatory dendritic cells in inflammatory responses during Trypanosoma evansi infection
Mekata H, Konnai S, Mingala CN, Abes NS, Gutierrez CA, Dargantes AP, Witola WH, Inoue N, Onuma M, Murata S, Ohashi K
Parasite Immunol., 34, 6, 318, 29, 2012年06月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular characterization of immunoinhibitory factors PD-1/PD-L1 in chickens infected with Marek's disease virus
Matsuyama-Kato A, Murata S, Isezaki M, Kano R, Takasaki S, Ichii O, Konnai S, Ohashi K
Virol J., 9, 94, 2012年05月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Increased bovine Tim-3 and its ligand expressions during bovine leukemia virus infection
Okagawa T, Konnai S, Ikebuchi R, Suzuki S, Shirai T, Sunden Y, Onuma M, Murata S, Ohashi K
Vet Res., 43, 1, 45, 45, 2012年05月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The immunoinhibitory receptor T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (Tim-3) and its ligand, galectin-9 (Gal-9), are involved in the immune evasion mechanisms for several pathogens causing chronic infections. However, there is no report concerning the role of Tim-3 in diseases of domestic animals. In this study, cDNA encoding for bovine Tim-3 and Gal-9 were cloned and sequenced, and their expression and role in immune reactivation were analyzed in bovine leukemia virus (BLV)-infected cattle. Predicted amino acid sequences of Tim-3 and Gal-9 shared high homologies with human and mouse homologues. Functional domains, including tyrosine kinase phosphorylation motif in the intracellular domain of Tim-3 were highly conserved among cattle and other species. Quantitative real-time PCR analysis showed that bovine Tim-3 mRNA is mainly expressed in T cells such as CD4+ and CD8+ cells, while Gal-9 mRNA is mainly expressed in monocyte and T cells. Tim-3 mRNA expression in CD4+ and CD8+ cells was upregulated during disease progression of BLV infection. Interestingly, expression levels for Tim-3 and Gal-9 correlated positively with viral load in infected cattle. Furthermore, Tim-3 expression level closely correlated with up-regulation of IL-10 in infected cattle. The expression of IFN-γ and IL-2 mRNA was upregulated when PBMC from BLV-infected cattle were cultured with Cos-7 cells expressing Tim-3 to inhibit the Tim-3/Gal-9 pathway. Moreover, combined blockade of the Tim-3/Gal-9 and PD-1/PD-L1 pathways significantly promoted IFN-γ mRNA expression compared with blockade of the PD-1/PD-L1 pathway alone. These results suggest that Tim-3 is involved in the suppression of T cell function during BLV infection.

Molecular cloning and characterization of Th1 and Th2 cytokines of African buffalo (Syncerus caffer)
Suzuki S, Konnai S, Okagawa T, Githaka NW, Kariuki E, Gakuya F, Kanduma E, Shirai T, Ikebuchi R, Ikenaka Y, Ishizuka M, Murata S, Ohashi K
Int J Immunogenet., 39, 2, 170, 82, 2012年04月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Identification of TROSPA homologue in Ixodes persulcatus Schulze, the specific vector for human Lyme borreliosis in Japan.
Konnai S, Yamada S, Imamura S, Nishikado H, Githaka N, Ito T, Takano A, Kawabata H, Murata S, Ohashi K
Ticks and Tick-borne Diseases, 2, 75, 77, 2012年, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Molecular cloning of bovine lymphocyte activation gene-3 and its expression characteristics in bovine leukemia virus-infected cattle
Shirai T, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Suzuki S, Sunden Y, Onuma M, Murata S, Ohashi K
Vet Immunol Immunopathol., 144, 3-4, 462, 7, 2011年12月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Lymphocyte activation gene-3 (LAG-3), a major histocompatibility complex (MHC) class II binding CD4 homologue has recently been shown as one of the mechanisms for down-regulating immune responses during chronic disease progression. For the first time, we cloned LAG-3 from two breeds of cattle (Holstein and Japanese Black), and analyzed its expression levels in cattle infected with bovine leukemia virus (BLV), a chronic viral infection that leads to immuno-suppression. The cloned cDNA of bovine LAG-3 have an open reading frame of 1551 nucleotides, encoding a polypeptide of 515 amino acids in length. Similar to the swine LAG-3, the bovine LAG-3 protein sequence consisted of four extracellular domains, a transmembrane domain and an inhibitory motif, KTGELE. We found that the bovine LAG-3 mRNA transcripts were expressed predominantly on T-cells such as CD4(+) and CD8(+) cells, among peripheral blood mononuclear cells. In subsequent expression analysis, LAG-3 mRNA expression on CD4(+) T-cells from BLV-infected cattle was upregulated compared to that in normal cattle. Comparable results were obtained with CD8(+) T-cells from cattle infected with BLV. We further observed strong upregualtion of MHC class II molecule, the ligand for LAG-3 in BLV-infected cattle. These findings indicate an important role for inhibitory receptor molecules such as LAG-3 in chronic bovine infections and future studies will elucidate the specific role of LAG-3 in bovine diseases.

Increase of cells expressing PD-L1 in bovine leukemia virus infection and enhancement of anti-viral immune responses in vitro via PD-L1 blockade
Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K
Vet Res., 42, 103, 103, 2011年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The inhibitory receptor programmed death-1 (PD-1) and its ligand, programmed death-ligand 1 (PD-L1) are involved in immune evasion mechanisms for several pathogens causing chronic infections. Blockade of the PD-1/PD-L1 pathway restores anti-virus immune responses, with concomitant reduction in viral load. In a previous report, we showed that, in bovine leukemia virus (BLV) infection, the expression of bovine PD-1 is closely associated with disease progression. However, the functions of bovine PD-L1 are still unknown. To investigate the role of PD-L1 in BLV infection, we identified the bovine PD-L1 gene, and examined PD-L1 expression in BLV-infected cattle in comparison with uninfected cattle. The deduced amino acid sequence of bovine PD-L1 shows high homology to the human and mouse PD-L1. The proportion of PD-L1 positive cells, especially among B cells, was upregulated in cattle with the late stage of the disease compared to cattle at the aleukemic infection stage or uninfected cattle. The proportion of PD-L1 positive cells correlated positively with prediction markers for the progression of the disease such as leukocyte number, virus load and virus titer whilst on the contrary, it inversely correlated with the degree of interferon-gamma expression. Blockade of the PD-1/PD-L1 pathway in vitro by PD-L1-specific antibody upregulated the production of interleukin-2 and interferon-gamma, and correspondingly, downregulated the BLV provirus load and the proportion of BLV-gp51 expressing cells. These data suggest that PD-L1 induces immunoinhibition in disease progressed cattle during chronic BLV infection. Therefore, PD-L1 would be a potential target for developing immunotherapies against BLV infection.

Analysis of transcriptional activities of the Meq proteins present in highly virulent Marek's disease virus strains, RB1B and Md5
Murata S, Okada T, Kano R, Hayashi Y, Hashiguchi T, Onuma M, Konnai S, Ohashi K
Virus Genes., 43, 1, 66, 71, 2011年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Marek's disease virus (MDV) is an oncogenic herpesvirus that causes malignant lymphomas in chickens. Recent field isolates of MDV have tended to exhibit increasing virulence, and MDV strains are currently classified into four categories based on their relative virulence. Meq, a putative MDV oncoprotein, resembles the Jun/Fos family of basic leucine zipper (bZIP) transcription factors and can regulate the expression of viral and cellular genes as a homodimer or as a heterodimer with a variety of bZIP family proteins. MDV isolates display distinct diversity and point mutations in Meq, which may contribute to changes in the transcriptional activities of Meq and subsequently, to observed increases in MDV oncogenicity. In this study, we introduced mutations into the meq gene and used dual luciferase reporter assays to analyze the transcriptional activities of the resulting Meq proteins to determine whether distinct mutations in Meq could be responsible for differences in transcriptional activity among MDV strains. A proline-to-alanine substitution at position 217, the second position of one of the proline direct repeats in the transactivation domain, enhanced the transactivation activity of Meq. In addition, we found that two substitutions at positions 283 and 320 affected transactivation activity. These results suggest that the distinct diversity of and point mutations in the Meq proteins are responsible for differences in transactivation activity among MDV strains.

Molecular detection of Anaplasma phagocytophilum in cattle and Ixodes persulcatus ticks
Yusuke Murase, Satoru Konnai, Arata Hidano, Naftali W. Githaka, Takuya Ito, Ai Takano, Hiroki Kawabata, Manabu Ato, Tomoko Tajima, Motoshi Tajima, Misao Onuma, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Veterinary Microbiology, 149, 3-4, 504, 507, Elsevier BV, 2011年05月
研究論文（学術雑誌）

Molecular identification and expression analysis of lipocalins from blood feeding taiga tick, Ixodes persulcatus Schulze
Satoru Konnai, Hideto Nishikado, Shinji Yamada, Saiki Imamura, Takuya Ito, Misao Onuma, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi
Experimental Parasitology, 127, 2, 467, 474, Elsevier BV, 2011年02月, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Lipocalins have been known for their several biological activities in blood-sucking arthropods. Recently, the identification and characterization of lipocalins from Ixodes ricinus (LIRs) have been reported and functions of lipocalins are well documented. In this study, we have characterized four Ixodes persulcatus lipocalins that were discovered while analyzing I. persulcatus tick salivary gland EST library. We show that the four I. persulcatus lipocalins, here after named LIPERs (lipocalin from I. persulcatus) are 28.8-94.4% identical to LIRs from I. ricinus. Reverse transcriptase-PCR analysis revealed that lipocalin genes were expressed specifically in the salivary glands throughout life cycle stages of the ticks and were up-regulated by blood feeding. The specific expressions were also confirmed by Western blotting analysis. Furthermore, to investigate whether native lipocalins are secreted into the host during tick feeding, the reactivity of anti-serum raised against saliva of adult ticks to recombinant lipocalins was tested by Western blotting. The lipocalins are potentially secreted into the host during tick feeding as revealed by specific reactivity of recombinant lipocalins with mouse antibodies to I. persulcatus tick saliva. Preliminary vaccination of mice with recombinant lipocalins elicited that period to reach engorgement was significantly delayed and the engorgement weight was significantly reduced as compared to the control. Further elucidation of the biological functions of LIPERs are required to fully understand the pathways involved in the modulation of host immune responses.

Cross immunity with Haemaphysalis longicornis glutathione S-transferase reduces an experimental Rhipicephalus (Boophilus) microplus infestation
Luís Fernando Parizi, Kiyoko Uemura Utiumi, Saiki Imamura, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, Aoi Masuda, Itabajara da Silva Vaz
Experimental Parasitology, 127, 1, 113, 118, Elsevier BV, 2011年01月
研究論文（学術雑誌）

Characterization of CTLA-4, PD-1 and PDL-1 of swamp and riverine type water buffaloes
Claro N. Mingala, Satoru Konnai, Ryoyo Ikebuchi, Kazuhiko Ohashi
Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 34, 1, 55, 63, Elsevier BV, 2011年01月
研究論文（学術雑誌）

Virological and Serological Studies of Porcine Respiratory Coronavirus Infection on a Japanese Farm
MEKATA Hirohisa, KONNAI Satoru, SIMUUNZA Martin, CHEMBENSOFU Mwelwa, KANO Rika, WITOLA William H., TEMBO Mwase E., CHITAMBO Harrison, INOUE Noboru, ONUMA Misao, OHASHI Kazuhiko
Journal of Veterinary Medical Science, 70, 9, 923, 928, JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE, 2008年
英語, The prevalence of trypanosome infections in tsetse flies, Glossina pallidipes, collected from Chiawa and Chakwenga in Zambia with endemic trypanosomosis was assessed by polymerase chain reaction (PCR). Out of the 550 G. pallidipes, 58 (10.5%) flies were found to harbor trypanosome DNA. Infection rates of tsetse with Trypanosoma vivax universal, Trypanosoma congolense savannah, T. congolense forest and T. congolense kilifi were 4.2% (23/550), 4.7% (26/550), 1.1% (6/550) and 1.6% (9/550), respectively. To determine the mammalian hosts of T. congolense and T. vivax infections from the tsetse flies, mammalian mitochondrion DNA of blood meal in these flies were analyzed by PCR and subsequent gene sequence analysis of the amplicons. Sequence analysis showed the presence of cytochrome b gene (cyt b) of 7 different mammalian species such as human, elephant, buffalo, goat, warthog, greater kudu and cattle. Goats which were main livestock in these areas were further examined to know the extent of its contribution in spreading the infection. We examined the prevalence of trypanosome infections in the domestic goat population in 6 settlements in Chiawa alone. Of the 86 goats sampled, 4 (4.6%), 5 (5.8%), 4 (4.6%) and 4 (4.6%) were positive for T. vivax universal, T. congolense savannah, forest and kilifi, respectively. These findings showed that the host-source of trypanosome infections in vector fly give a vital information about spread of infection. The result of this study will certainly contribute in elucidating more the epidemiology of trypanosomosis.

野生鳥類の大量死の原因となり得る病原体に関する情報収集_-_蓄積_-_解析_-_公開システムの試作について
長 雄一, 赤松 里香, 高田 雅之, 大橋 和彦, 岡崎 克則, 金子 正美, 遠藤 大二, 浅川 満彦, 坪田 敏男, 淺野 玄
日本生態学会大会講演要旨集, 52, 432, 432, 日本生態学会, 2005年
生態学会２００４年大会において「野生鳥類の大量死リスク評価につながる病原体データベースの基本コンセプトについて」を発表し、病原体情報の収集分析のために、広域サンプリング_-_＞病原体タイプの同定_-_＞情報管理・蓄積_-_＞情報解析_-_＞情報公開及び活用といった基本的なコンセプト（設計図）を提示した。
本発表においては、これらのコンセプトに基づいたシステムの実際的な運用例等を示すとともに、２００３年度に実施したサンプリングにより把握できた野生鳥類における病原体保有動態について中間的な報告を行う。また、実際に罹病あるいは死亡した個体に関する病原体（死因）情報のフォーマットや、「情報の共通化・共有化」等の具体的な運用面の問題についても述べる。さらに野生鳥類の移動_-_分散様式・病原体の伝播_-_発病様式・湖沼等の生息環境の空間構造・人間活動との相互作用を視野においた野生鳥類大量死発生予測モデリングについて手法検討を行う。

Cloning and sequence analysis of llama cytokines related to cell-mediated immunity
Raadan Odbileg, Sung-Il Lee, Reiko Yoshida, Kyung-Soo Chang, Kazuhiko Ohashi, Chihiro Sugimoto, Misao Onuma
Veterinary Immunology and Immunopathology, 99, 1-2, 1, 10, Elsevier, 2004年
英語, 研究論文（学術雑誌）

日本におけるニューカッスル病ウイルス株のヌクレオカプシド蛋白遺伝子の分子的特徴と制限酵素-based rapid pathotyping法の開発(Molecular characterization of the nucleocapsid protein gene of Newcastle disease virus strains in Japan and development of a restriction enzyme-based rapid pathotyping method)　　　　　　　　　　　　　　　
ファン・ハンミン, 張 景洙, 真瀬 昌司, 大橋 和彦, 小沼 操
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 135回, 127, 127, (公社)日本獣医学会, 2003年03月
英語

Protective effect of orally administered human interferon (HuIFN)-alpha against systemic Listeria monocytogenes infection and a practical advantage of HUIFN-alpha derived from transgenic potato plant
K Ohya, T Matsumura, N Itchoda, K Ohashi, M Onuma, C Sugimoto
PLANT BIOTECHNOLOGY 2002 AND BEYOND, 389, 391, 2003年, ［査読有り］
英語, 研究論文（国際会議プロシーディングス）

Erratum: Seroprevalence and molecular evidence for the presence of bovine immunodeficiency virus in Brazilian cattle (Japanese Journal of Veterinary Research (2002) vol. 50 (1) (9-16))　　　　　　　　　　　　　　　
Sothy Meas, Farias Jeronimo Ruas, Tatsufumi Usui, Yoshiyuki Teraoka, Albert Mulenga, Kyung-Soo Chang, Aoi Masuda, Claudo Roberto Madruga, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma
Japanese Journal of Veterinary Research, 50, 2-3, 145, 2002年11月
英語, 研究論文（学術雑誌）

BLV-Tax発現DNAワクチンのウイルス増殖抑制効果　　　　　　　　　　　　　　　
笛吹 達史, 今内 覚, 田島 茂, 渡来 仁, 大橋 和彦, 間 陽子, 小沼 操
日本獣医学会学術集会講演要旨集, 133回, 95, 95, (公社)日本獣医学会, 2002年03月
日本語

Seroprevalence and molecular evidence for the presence of bovine immunodeficiency virus in Brazilian cattle
Sothy Meas, Farias Jeronimo Ruas, Tatsufumi Usui, Yoshiyuki Teraoka, Albert Mulenga, Kyung-Soo Chang, Aoi Masuda, Claudo Roberto Madruga, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma
The Japanese journal of veterinary research, 50, 1, 9, 16, 2002年
英語, 研究論文（学術雑誌）

牛白血病ウイルス感染症における宿主免疫応答 (総説)
壁谷 英則, 大橋 和彦, 小沼 操
The journal of veterinary medical science, 63, 7, 703, 708, s・iii, 社団法人日本獣医学会, 2001年07月
英語, 牛白血病ウイルス(BLV)は牛のB細胞に感染し, 地方病性白血病を引き起こすC型レトロウイルスである. BLV感染による白血病の発症には長い潜伏期間を要することから, BLVは宿主免疫系との間に密接な関係をもつと考えられる. 本総説では, BLV感染症における病熊の進行と宿主免疫応答との間における密接な関係について示した報告について総括する. まずはじめにBLV感染防御における細胞性免疫の重要な役割について述べる. 次いで, 本疾病における病態の進行とサイトカインプロファイルの変化との関連性について考察した. われわれは, BLVによる白血病発症の過程において特に腫瘍壊死因子α(TNFα)とその2つのタイプのレセプターの役割に着目している. BLVの排除においてTNFαが重要な役割を担うと同時に, そのレセプターの発現パターンの変化が病態発現に深く関わっている可能性がある. TNFαの発現は主要組織適合抗原複合体(MHC)ハプロタイプに規定されている. BLV感染症に対する感染抵抗性は, MHCハプロタイブと深い関係を持ついくつかの要因によって決定されると考えられる. 最後にMHCハプロタイプを基準にした育種によるBLV感染症のコントロールについて述べる. 本総説ではわれわれの成績を中心に, 最近の報告について紹介する.

Seroprevalence of Bovine Immunodeficiency Virus in Dairy and Beef Cattle Herds in Korea
Kyoung-Oh Cho, Sothy Meas, Nam-Yong Park, Yong-Hwan Kim, Yoon-Kyu Lim, Daiji Endoh, Sung-Il Lee, Kazuhiko Ohashi, Chihiro Sugimoto, Misao Onuma
Journal of Veterinary Medical Science, 61, 5, 549, 551, 1999年05月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Pathogenesis of Marek's Disease(MD) and Possible Mechanisms of Immunity Induced by MD Vaccine.
MORIMURA Toshifumi, OHASHI Kazuhiko, SUGIMOTO Chihiro, ONUMA Misao
Journal of Veterinary Medical Science, 60, 1, 1, 8, JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE, 1998年
英語, Marek's disease (MD) is a lymphoproliferative disease of chicken, which is characterized by malignant T cell-lymphoma formation. This disease can be effectively prevented by vaccination with attenuated MD virus (MDV), apathogenic MDV or herpesvirus of turkey. MD vaccines are ones of a few vaccines which can prevent virus-induced tumor among mammalian and avian species. To determine the roles of T cell subsets in the protection mechanism, chickens vaccinated with an attenuated MDV (CVI988) were depleted of either CD4⁺ or CD8⁺T cells by neonatal thymectomy and injections of monoclonal antibodies against chicken CD4 or CD8 molecules and then challenged with an oncogenic MDV. These birds were effectively protected from MDV-induced tumors. However, virus titers in CD4⁺T cells, which are the main target cells for MDV-latent infection and subsequent transformation, were much higher in CD8-deficient vaccinated chickens than in untreated vaccinated chickens at the early stage of the latent phase. These results suggested that CD8⁺T cell responses induced by the MD vaccine are essential for anti-virus but not anti-tumor effects. Here, we will discuss how the attenuated vaccine prevents chickens from lymphoma-formation by an oncogenic MDV.

マレック病ウイルス日本分離株meq遺伝子の多型による病原性と転写調節能への影響
もたい吉之介, 村田史郎, 村田史郎, 佐藤純平, 山上竣裕, SHWE Win Yee, 堀尾文彌, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 今内覚, 今内覚, 大橋和彦, 大橋和彦, 大橋和彦, 日本ウイルス学会学術集会プログラム・予稿集(Web), 71st, 2024年

マレック病ウイルスMeqタンパク質の塩基性領域におけるアミノ酸多型の病原性への影響
佐藤純平, 村田史郎, 村田史郎, もたい吉之介, 山上竣裕, 堀尾文彌, SHWE Win Yee, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 今内覚, 今内覚, 大橋和彦, 大橋和彦, 大橋和彦, 日本ウイルス学会学術集会プログラム・予稿集(Web), 71st, 2024年

非典型的な地方病性牛伝染性リンパ腫症例のRAISING法を用いた性状解析
松原幸芽, 岡川朋弘, 斎藤益満, 松平崇弘, 直亨則, 神谷可菜, 齋藤麻矢, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 今内覚, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 167th, 2024年

抗PD-L1抗体により治療した悪性黒色腫の犬における血清バイオマーカーの探索
飯高早紀子, 前川直也, 今内覚, 出口辰弥, 岡川朋弘, 高木哲, 高木哲, 鈴木定彦, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 167th, 2024年

プロバイオティクスによる子牛のワクチン効果増強作用の検証
池端麻里, 岡川朋弘, 中村隼人, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 今内覚, 今内覚, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 167th, 2024年

日本に分布するマレック病ウイルスmeq遺伝子による病原性への影響
もたい吉之介, 村田史郎, 佐藤純平, 山上竣裕, WIN Shwe Yee, 堀尾文彌, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 167th, 2024年

ワクモ曝露型抗原による抗ワクモワクチン抗原としての評価
堀尾文彌, 村田史郎, ウィン シュウェ・イー, 佐藤純平, もたい吉之介, 山上竣裕, 佐藤匠, 大石英司, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 167th, 2024年

マレック病ウイルスmeq遺伝子の転写活性化調節ドメインの多型と病原性との関連
山上竣裕, 村田史郎, 佐藤純平, もたい吉之介, WIN Shwe Yee, 堀尾文彌, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 167th, 2024年

抗ワクモワクチンを用いたワクモの制御法の開発(1)
大橋和彦, 村田史郎, 鶏の研究, 99, 6, 2024年

抗ワクモワクチンを用いたワクモの制御法の開発(2)
大橋和彦, 村田史郎, 鶏の研究, 99, 8, 2024年

抗ワクモワクチンを用いたワクモの制御法の開発(3)
大橋和彦, 村田史郎, 鶏の研究, 99, 10, 2024年

牛伝染性リンパ腫の診断と早期発症予測法の開発
富永みその, 今内覚, 岡川朋弘, 神谷可菜, 齋藤麻矢, 安富一郎, 目堅博久, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道獣医師会雑誌, 67, 8, 2023年

地方病性牛伝染性リンパ腫における牛伝染性リンパ腫ウイルス/SMAD3融合遺伝子の検出
直亨則, 直亨則, 岡川朋弘, 野尻直未, 今内覚, 今内覚, 嶋倉穂南, 富永みその, 吉田初佳, 西山依里, 松平崇弘, 前川直也, 村田史郎, 村田史郎, 村松正道, 村松正道, 大橋和彦, 大橋和彦, 斎藤益満, 日本ウイルス学会学術集会プログラム・予稿集(Web), 70th, 2023年

免疫チェックポイント分子Programmed death-ligand1(PD-L1)を標的とした抗体薬による犬の鼻腔内腺癌に対する免疫療法の検討
多田佳史, 前川直也, 今内覚, 細谷謙次, 大脇稜, 竹内寛人, 賀川由美子, 高木哲, 高木哲, 鈴木定彦, 鈴木定彦, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 166th, 2023年

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染症における免疫チェックポイント因子TIM-3およびPD-L1を標的とした抗ウイルス効果の検討
中村隼人, 今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 166th, 2023年

クローナリティ解析による地方病性牛伝染性リンパ腫に対する発症予測法の開発
富永みその, 岡川朋弘, 嶋倉穂南, 斎藤益満, 松平崇弘, 直亨則, 山田慎二, 村上賢二, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 今内覚, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 166th, 2023年

マレック病ウイルスMeqタンパク質における挿入配列による病原性増強機構の解明
佐藤純平, 村田史郎, YEE Win Shwe, 瀬尾光里, もたい吉之介, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 166th, 2023年

新たに認められた欠損配列を持つマレック病ウイルスmeq遺伝子の性状解析
もたい吉之介, 村田史郎, 佐藤純平, 西明仁, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 166th, 2023年

牛伝染性リンパ腫ウイルス感染牛における分娩が及ぼす免疫抑制メカニズムの解析
富永みその, 今内覚, 佐治木大和, 岡川朋弘, 小原潤子, 似内厚之, 高橋博文, 窪田健太郎, 武田休史, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道獣医師会雑誌, 66, 8, 2022年

牛伝染性リンパ腫の病態発生機序解析を基盤とする新制御法の試み
今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 家畜衛生学雑誌, 47, 3, 2021年

ブタPD-1/PD-L1経路の発現と機能解析【JST・京大機械翻訳】
OTGONTUYA Ganbaatar, 今内覚, 岡川朋弘, 野島裕太郎, 前川直也, 市川世識, 小林篤史, 芝原友幸, 柳川洋二郎, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164th (CD-ROM), 2021年

ワクモ(Dermanyssus gallinae)の吸血に対する宿主免疫応答の解明
藤澤宗太郎, 村田史郎, 伊勢崎政美, 佐藤匠, 大石英司, 種子野章, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 164th (CD-ROM), 2021年

動物用抗体医薬品の開発および臨床研究
今内 覚, 岡川 朋弘, 前川 直也, 中島 千絵, 鈴木 定彦, 山本 啓一, 戸田 幹洋, 村田 史郎, 大橋 和彦, JVPA digest : 日本動物用医薬品協会会報, 67, 1, 10, 2020年02月
日本動物薬事協会, 日本語

牛白血病の病態発生機序解析を基盤とする新制御法の試み
今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 畜産技術, 784, 2020年

分子標的薬-将来の展望 免疫チェックポイント阻害薬を用いた腫瘍免疫療法
前川直也, 今内覚, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦, Veterinary Oncology, 7, 2, 2020年

ネコCytotoxic T-lymphocyte antigen-4(CTLA-4)を標的とした新規免疫抑制剤の開発における基礎的検討
大塚拓海, 今内覚, 前川直也, 渡慧, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 163rd, 2020年

ワクモにおける定量的PCR法確立のための内在性コントロール遺伝子の探索
有泉拓馬, 村田史郎, 藤澤宗太郎, 伊勢崎政美, 前川直也, 岡川朋弘, 種子野章, 大石英司, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 163rd, 2020年

牛白血病ウイルス感染症における免疫抑制受容体TIM-3の発現解析および機能解析
中村隼人, 今内覚, 岡川朋弘, 佐治木大和, 渡慧, 神谷可菜, 齋藤麻矢, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 163rd, 2020年

ウシマイコプラズマ感染症における免疫疲弊化　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 後藤伸也, 岡川朋弘, 前川直也, 村田 史郎, 大橋和彦, 日本マイコプラズマ学会雑誌, 46, 31, 33, 2019年12月, ［招待有り］
日本語, 速報，短報，研究ノート等（学術雑誌）

ダニ研究の最前線とダニ媒介性感染症制御の可能性を探る: 病原体伝播に関わるマダニ因子 〜マダニ唾液中の免疫抑制因子〜　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 岡川朋弘, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, Med. Entomol. Zool., 70, 4, 189, 197, 2019年12月, ［査読有り］, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

免疫チェックポイント分子Programmed death‐ligand 1(PD‐L1)を標的とする抗体薬による免疫療法が奏功した肺転移のある口腔内悪性黒色腫の犬の1例
竹内寛人, 前川直也, 今内覚, 高木哲, 細谷謙次, 賀川由美子, 岡川朋弘, 鈴木定彦, 鈴木定彦, 山本啓一, 山本啓一, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道獣医師会雑誌, 63, 8, 343, 2019年08月09日
日本語

ロタウイルス実験感染子牛モデルを用いた3.5倍発酵代用乳の腸炎抑制効果の検証
茅先史, 今内覚, 久保田学, 岡川朋弘, 佐治木大和, 渡慧, 小原潤子, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道獣医師会雑誌, 63, 8, 302, 2019年08月09日
日本語

免疫学的解析を基盤とした動物用創薬研究　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 岡川朋弘, 前川直也, 中島千絵, 鈴木定彦, 山本啓一, 戸田幹洋, 村田史郎, 大橋和彦, 臨床獣医, 37, 3, 37, 41, 2019年03月, ［招待有り］
(株)緑書房, 日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

ワクモ由来Adipocyte plasma membrane-associated proteinの抗ワクモワクチン抗原としての評価
森田鮎, 竹原昌生, 村田史郎, 伊勢崎政美, 藤澤宗太郎, 種子野章, 酒井英史, 宇野有紀子, 小川遼, 市居修, 前川直也, 岡川朋弘, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 162nd, 2019年

動物難治性疾病に対する創薬研究　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 岡川朋弘, 前川直也, 中島千絵, 鈴木定彦, 山本啓一, 戸田幹洋, 村田史郎, 大橋和彦, MPアグロジャーナル, 35, 10, 22, 25, 2018年10月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

免疫チェックポイント分子を標的とした腫瘍免疫療法 抗PD-1/PD-L1抗体療法　　　　　　　　　　　　　　　
前川直也, 今内 覚, 村田史郎, 大橋和彦, 高木 哲, 獣医畜産新報, 71, 9, 659, 663, 2018年09月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

牛白血病における新規病態進行評価マーカーの検索
渡慧, 今内覚, 佐治木大和, 岡川朋弘, 前川直也, 後藤伸也, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道獣医師会雑誌, 62, 8, 282, 2018年08月24日
日本語

ヨーネ病におけるプロスタグランジンE₂(PGE₂)動態解析及びCOX‐2阻害剤の免疫活性化効果の検討
佐治木大和, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 前川直也, 後藤伸也, 永田礼子, 川治聡子, 森康行, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 341, 2018年08月21日
日本語

肺転移のある悪性黒色腫罹患犬に対するPD‐L1を標的とした抗体薬の治療効果
前川直也, 今内覚, 高木哲, 細谷謙次, 賀川由美子, 岡川朋弘, 和泉雄介, 出口辰弥, 鈴木定彦, 山本啓一, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 429, 2018年08月21日
日本語

マレック病ウイルスの病原性進化機構の解明―病原性試験や全ゲノム解析の試み
大橋和彦, 村田史郎, 町田柚香, 伊勢崎政美, 今内覚, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 216, 2018年08月21日
日本語

免疫抑制因子PD‐1およびPD‐L1を標的としたイヌ腫瘍に対する新規免疫療法の検討
前川直也, 今内覚, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 233, 2018年08月21日
日本語

動物難治性疾病の免疫学的解析を基盤とした新規制御法の開発
今内覚, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 202, 2018年08月21日
日本語

地方病性牛白血病の簡易鑑別診断基準の確立と若齢発症牛の実態調査
田中晶菜, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 前川直也, 戸塚知恵, 千葉由純, 池田昌穂, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 353, 2018年08月21日
日本語

ウシCytotoxic T‐lymphocyte antigen‐4(CTLA‐4)の機能解析および慢性感染症における発現解析
渡慧, 今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 後藤伸也, 佐治木大和, 村田史郎, 鈴木定彦, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 340, 2018年08月21日
日本語

イヌCytotoxic T‐lymphocyte antigen‐4(CTLA‐4)を標的としたバイオ医薬品の開発に向けた基礎的検討
石原悠太郎, 今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 鈴木定彦, 大田寛, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 430, 2018年08月21日
日本語

Mycoplasma bovis感染症における免疫抑制機序の解析
後藤伸也, 今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 佐治木大和, 渡慧, 樋口豪紀, 小岩政照, 田島誉士, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 342, 2018年08月21日
日本語

地方病性牛白血病若齢発症牛におけるプロウイルス挿入部位の網羅的解析
岡川朋弘, 今内覚, 西森朝美, 田中晶菜, 前川直也, 戸塚知恵, 千葉由純, 池田昌穂, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 351, 2018年08月21日
日本語

ミャンマー連邦共和国における鶏の吸血性外部寄生虫の分布状況調査
竹原昌生, 村田史郎, 片倉賢, MYINT MYINT Hmoon, SHWE YEE Win, SAW Bawm, LAT LAT Htun, YE HTUT Aung, MAR MAR Win, 伊勢崎政美, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 161st, 375, 2018年08月21日
日本語

ワクモ(Dermanyssus gallinae)由来カテプシンL用タンパク質の性状解析とワクチン抗原としての評価
村田史郎, 伊勢崎政美, 谷口綾香, 北條巧, 種子野章, 酒井英史, 宇野有紀子, 矢吹卓也, 市居修, 伊東拓也, 今内覚, 大橋和彦, 衛生動物, 69, 2, 103, 2018年06月25日
日本語

獣医療における抗体医薬の現状　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 村田史郎, 大橋和彦, 家畜診療, 65, 4, 233, 240, 2018年04月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

COX‐2阻害薬と抗PD‐L1抗体の併用によるイヌ腫瘍疾患の制御法の検討
浅野裕美恵, 今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 西森朝美, 後藤伸也, 高木哲, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 371, 2017年08月30日
日本語

PD‐L1を標的としたイヌ用キメラ抗体医薬の作製と悪性黒色腫および未分化肉腫罹患犬における抗腫瘍効果の検討
前川直也, 今内覚, 高木哲, 賀川由美子, 岡川朋弘, 西森朝美, 池渕良洋, 和泉雄介, 出口辰弥, 加藤幸成, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 460, 2017年08月30日
日本語

日本に分布するマレック病ウイルス野外株の病原性の検討
村田史郎, 種子野章, 酒井英史, 町田柚香, 松山あゆ美, 伊勢崎政美, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 405, 2017年08月30日
日本語

マレック病ウイルス弱毒株を用いた新規抗ワクモワクチン開発に向けた基礎研究
青山珠里愛, 村田史郎, 伊勢崎政美, 種子野章, 酒井英史, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 405, 2017年08月30日
日本語

牛マイコプラズマ感染症における免疫抑制機序の解明
後藤伸也, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 前川直也, 樋口豪紀, 小岩政照, 田島誉士, 小原潤子, 加藤幸成, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 370, 2017年08月30日
日本語

Theileria parva感染症における免疫チェックポイント因子の動態解析
今内覚, 岡山朋弘, 山田慎二, SIMUUNZA Martin, CONNELLEY Timothy, MORRISON Ivan, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 338, 2017年08月30日
日本語

牛白血病ウイルス(BLV)感染症においてプロスタグランジンE₂(PGE₂)が及ぼす免疫抑制機序の解明
佐治木大和, 今内覚, 西森朝美, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 370, 2017年08月30日
日本語

BLV感染症をモデルとした抗ウシPD‐L1キメラ抗体の臨床応用試験
西森朝美, 今内覚, 岡川朋弘, 前川直也, 池渕良洋, 後藤伸也, 佐治木大和, 鈴木定彦, 小原潤子, 小笠原諭, 加藤幸成, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 160th, 370, 2017年08月30日
日本語

牛白血病ウイルス(BLV)感染ハイリスク牛における初めての子宮内感染直接証明　　　　　　　　　　　　　　　
佐治木 大和, 今内 覚, 西森 朝美, 岡川 朋弘, 永野 昌志, 小原 潤子, 村田 史郎, 大橋 和彦, 北海道獣医師会雑誌, 61, 8, 280, 280, 2017年08月
(公社)北海道獣医師会, 日本語

マダニ唾液由来因子の病原体伝播における役割
今内覚, 伊東拓也, 高野愛, 川端寛樹, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 日本細菌学雑誌(Web), 72, 1, 35(J‐STAGE), 2017年
日本語

ウシCytotoxic T‐lymphocyte antigen‐4(CTLA‐4)の機能解析と特異抗体の樹立
渡慧, 今内覚, 前川直也, 岡川朋弘, 西森朝美, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 159th, 365, 365, 2016年08月30日
(公社)日本獣医学会, 日本語

家畜における免疫チェックポイント関連因子の遺伝子比較解析とウシ用抗体を用いた動物種横断的研究
野島裕太郎, 今内覚, 西森朝美, 前川直也, 岡川朋弘, 森康行, 賀川由美子, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 159th, 364, 2016年08月30日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)由来sialostatinL2の機能解析
越智晶絵, 今内覚, 伊東拓也, 川端寛樹, 高野愛, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 159th, 339, 2016年08月30日
日本語

抗ワクモ(Dermanyssus gallinae)ワクチン開発に向けたワクモ由来フェリチン2の性状解析
伊勢崎政美, 村田史郎, 酒井英史, 矢吹卓也, 種子野章, 市居修, 伊東拓也, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 159th, 399, 2016年08月30日
日本語

ウシ腫瘍壊死因子(TNF‐α)デコイレセプターによる新規抗炎症剤の開発
藤澤宗太郎, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 前川直也, 村田史郎, 鈴木定彦, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 159th, 364, 2016年08月30日
日本語

マレック病ウイルス日本分離株の全ゲノム解析
村田史郎, 町田柚香, 伊勢崎政美, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 159th, 399, 2016年08月30日
日本語

牛白血病への対策を練る〜牛白血病について〜
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦, 養牛の友, 7, 484, 32, 36, 2016年07月, ［招待有り］
日本畜産振興会, 日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

増加する牛白血病とその対策
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦, 農家の友, 68, 2, 108, 110, 2016年02月, ［招待有り］
北海道農業改良普及協会, 日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

イヌ腫瘍浸潤リンパ球におけるPD‐1発現解析と免疫チェックポイント分子を標的とした新規腫瘍免疫療法の検討
前川直也, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 足立真実, 高木哲, 賀川由美子, 賀川由美子, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 405, 2015年08月30日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)唾液腺由来免疫抑制因子sL2の同定および機能解析
越智晶絵, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 前川直也, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 301, 2015年08月30日
日本語

牛白血病ウイルス感染症における疲弊化T細胞の動態とその再活性化
岡川朋弘, 今内覚, 西森朝美, 前川直也, 池渕良洋, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 324, 2015年08月30日
日本語

日本に分布するマレック病ウイルス野外株の分離
町田柚香, 村田史郎, 伊勢崎政美, 酒井英史, 種子野章, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 354, 2015年08月30日
日本語

日本国内における牛白血病若齢発症牛の実態調査と表現型解析
西森朝美, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 中原綾子, 千葉由純, 戸塚知恵, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 336, 2015年08月30日
日本語

ワクモ(Dermanyssus gallinae)由来カテプシンL様タンパク質の性状解析とワクチン抗原としての評価
北條巧, 谷口綾香, 村田史郎, 伊勢崎政美, 酒井英史, 矢吹卓也, 寺田晴菜, 種子野章, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 353, 2015年08月30日
日本語

マレック病ウイルスmeq遺伝子に認められた欠損配列
村田史郎, 山本英次, 坂下奈津美, 松山あゆ美, 伊勢崎政美, 町田柚香, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 354, 2015年08月30日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)由来Salp15因子によるライム病ボレリア伝播促進機能の解析
村瀬優介, 今内覚, 伊東拓也, 高野愛, 川端寛樹, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 158th, 301, 2015年08月30日
日本語

マレック病ウイルス癌遺伝子(Meq)と病原性との関連
高木道浩, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 鶏病研究会報, 50, 4, 199, 205, 2015年02月25日
日本語

牛白血病ウイルス感染牛におけるナチュラル・キラー細胞の動態および機能解析
中原綾子, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 西森朝美, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 157th, 388, 2014年08月11日
日本語

ウシ制御性T細胞の機能解析および慢性感染症における動態解析
大平浩輔, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 前川直也, 中原綾子, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 157th, 388, 2014年08月11日
日本語

イヌ免疫抑制因子PD‐1およびPD‐L1を標的とした新規腫瘍免疫療法の検討
前川直也, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 足立真実, 高木哲, 賀川由美子, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 157th, 483, 2014年08月11日
日本語

Direct PCR法を用いた全血からの牛白血病ウイルス迅速簡易診断法の検討
西森朝美, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 大平浩輔, 中原綾子, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 157th, 424, 2014年08月11日
日本語

野生鳥類―畜産防疫の手引き~牛舎に侵入する野生鳥類~
長雄一, 大越安吾, 平井綱雄, 藤井啓, 大橋和彦, 村田史郎, 遠藤大二, 金子正美, 田中克佳, 浅川満彦, 酪農ジャーナル, 67, 8, 29, 31, 2014年08月01日
日本語

シュルツェマダニ(lxodes persulcatus)由来因子の宿主免疫抑制機能の解析
今内覚, 伊東拓也, 川端寛樹, 高野愛, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 大原綜合病院年報, 53, 65, 2013年12月15日
日本語

免疫抑制受容体PD-1のリガンドPD-L2の機能的特徴と臨床応用研究　　　　　　　　　　　　　　　
西森朝美, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦, 動物ワクチン-バイオ医薬品研究会ニュースレター, 8, 18, 19, 2013年12月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

牛白血病ウイルスの感染予防対策　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦, DAIRYMAN, 63, 9, 42, 43, 2013年09月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

イヌ免疫抑制因子PD‐1およびPD‐L1の同定と新規免疫療法樹立への基礎研究
前川直也, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 高木哲, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 257, 2013年08月30日
日本語

牛白血病ウイルス感染牛由来IgM^high B細胞とIgM^low B細胞のウイルス抗原発現解析及び性状解析
池渕良洋, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 中原綾子, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 271, 2013年08月30日
日本語

マレック病腫瘍病変形成における免疫抑制因子発現機序の検討
松山あゆ美, 村田史郎, 伊勢崎政美, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 257, 2013年08月30日
日本語

シュルツェマダニ由来免疫抑制因子の機能解析
豊間根耕地, 今内覚, 伊東拓也, 川端寛樹, 高野愛, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 235, 2013年08月30日
日本語

全血培養法によるエンドトキシン活性測定の有用性の検討
今村彩貴, 中溝万里, 川西路子, 池渕良洋, 目堅博久, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 中島奈緒, 山本欣也, 内山万利小, 平野文哉, 永井英貴, 木島まゆみ, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 260, 2013年08月30日
日本語

国内に潜在すると考えられる新興回帰熱に関する疫学調査研究
高野愛, 川端寛樹, 大久保(佐藤)梢, 中尾稔, 伊東拓也, TAYLOR Kyle, 李景利, 坪田敏男, 今内覚, 吉村英紘, 豊間根耕地, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 304, 2013年08月30日
日本語

ウシ免疫抑制因子PD‐L1およびPD‐L2の組換えタンパク質作製と免疫機能解析
西森朝美, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 257, 2013年08月30日
日本語

牛白血病発生農場におけるサシバエ種の同定とウイルスの検出
今内覚, 豊間根耕地, 小池菜々子, 伊東拓也, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 156th, 231, 2013年08月30日
日本語

シュルツェマダニにおける病原体伝播関連因子の同定.
今内覚, 川端寛樹, 伊東拓也, 高野愛, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 衛生動物, 64, 2, 112, 2013年06月15日
日本語

スーラ病の分子疫学調査および野外分離株を用いた比較病原性解析と病態発生機序の解明
目堅博久, 今内覚, MINGALA Claro N, 井上昇, 村田史郎, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 155th, 81, 2013年03月04日
日本語

RNA用試料抽出・保存用濾紙のRNAウイルスPCR検出への利用
松山智慧麿, 遠藤大二, 大橋和彦, 今内覚, 村田史郎, 有川二郎, 吉松組子, 水谷哲也, 林正信, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 155th, 229, 2013年03月04日
日本語

シュルツェマダニ由来因子の病原体伝播における機能解析
今内覚, 川端寛樹, 伊東拓也, 高野愛, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦, 大原綜合病院年報, 52, 105, 106, 2012年12月15日
日本語

感染症と免疫の基礎 臨床現場で役立つ免疫の知識　　　　　　　　　　　　　　　
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚, 臨床獣医, 11, 50, 52, 2012年11月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

感染症と免疫の基礎 細胞性免疫　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦, 臨床獣医, 10, 42, 44, 2012年10月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

感染症と免疫の基礎 液性免疫　　　　　　　　　　　　　　　
村田 史郎, 今内 覚, 大橋 和彦, 臨床獣医, 9, 60, 62, 2012年09月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

ワクモDermanyssus gallinae由来発現遺伝子の網羅的解析
伊勢崎政美, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 203, 2012年08月31日
日本語

フィリピン共和国におけるTrypanosoma evansi野外流行株の分離および比較病原性解析
今内覚, 目堅博久, CLARO Mingala, NANCY Abes, ALAN Dargantes, 井上昇, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 213, 2012年08月31日
日本語

マレック病ウイルスワクチン接種鶏における免疫抑制因子PD‐1およびPD‐L1の発現解析
高崎紗蘭, 村田史郎, 松山あゆ美, 伊勢崎政美, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 234, 2012年08月31日
日本語

牛白血病ウイルス感染牛における免疫抑制因子Tim‐3/Gal‐9の発現解析および機能解析
岡川朋弘, 今内覚, 池渕良洋, 鈴木紗織, 寸田祐嗣, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 233, 2012年08月31日
日本語

マレック病感染鶏由来腫瘍病変部における免疫抑制因子PD‐1/PD‐L1発現の形態学的解析
村田史郎, 松山あゆ美, 伊勢崎政美, 高崎紗蘭, 市居修, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 234, 2012年08月31日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)唾液腺由来免疫抑制因子sL2の同定および発現解析
高田春奈, 今内覚, NAFTALY Githaka, 伊勢崎政美, 伊東拓也, 安藤秀二, 川端寛樹, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 204, 2012年08月31日
日本語

ウシの免疫抑制受容体PD‐1に対するモノクローナル抗体の作製および免疫活性化能の検討
池渕良洋, 今内覚, 岡川朋弘, 横山和正, 中島千絵, 鈴木定彦, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 154th, 233, 2012年08月31日
日本語

増加している牛白血病 〜北海道での現状と対策について〜　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦, 北海道獣医師会雑誌., 56, 1, 7, 2012年07月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

ウシ難治性疾病に対する多機能型新規治療法の開発　　　　　　　　　　　　　　　
岡川朋弘, 今内覚, 池渕良洋, 鈴木紗織, 村田史郎, 大橋和彦, 動物ワクチン-バイオ医薬品研究会ニュースレター, 5, 21, 23, 2012年06月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

地方病性牛白血病腫瘍組織における免疫抑制因子PD‐L1の発現とその役割
寸田祐嗣, 竹林賢作, 今内覚, 池渕良洋, 大橋和彦, 落合謙爾, 梅村孝司, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 153rd, 203, 2012年03月01日
日本語

Theileria parva感染牛属のサイトカイン発現比較解析　　　　　　　　　　　　　　　
岡川朋弘, 今内覚, Githaka N, 目堅博久, 鈴木紗織, Kariuki E, Skilton R, 石塚真由美, 村田史郎, 大橋和彦, 獣医寄生虫学会誌, 10, 1-2, 37, 2012年03月
日本語, 速報，短報，研究ノート等（学術雑誌）

Babesia ovata感染宿主有核細胞の培養系産物を抗原としたELISAによる抗体検出系
児玉道, 荻原喜久美, 納谷裕子, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 岸川正剛, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 153rd, 223, 2012年03月01日
日本語

牛難治性疾病に対する免疫抑制因子を標的とした治療型ワクチンの開発
今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 鈴木紗織, 白井達哉, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 153rd, 117, 2012年03月01日
日本語

牛白血病ウイルス感染牛における免疫抑制因子PD‐1/PL‐L1の発現解析および機能解析
池渕良洋, 今内覚, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医師会獣医学術学会年次大会講演要旨集, 2011, 45, 2012年01月20日
日本語

ウシTim-3の発現・機能解析と新規疾病制御法への応用展開　　　　　　　　　　　　　　　
岡川朋弘, 今内覚, 池渕良洋, 鈴木紗織, 村田史郎, 大橋和彦, 動物ワクチン-バイオ医薬品研究会ニュースレター, 4, 27, 29, 2011年12月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

牛白血病の感染予防対策 最終回 4 ある農場における清浄化の取り組み事例
今内覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Jpn, 56, 15, 63, 65, 2011年12月01日
日本語

牛白血病の感染予防対策 —診療・生産現場からの声に対して—　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Japan, 12, 62, 64, 2011年12月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

牛白血病の感染予防対策 3 牛白血病に対する風評被害と間違った知識とは?
今内覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Jpn, 56, 14, 38, 40, 2011年11月01日
日本語

牛白血病の感染予防対策 牛白血病に対する風評被害と間違った知識とは？　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Japan, 11, 57, 58, 2011年11月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

牛白血病の感染予防対策 —今からできる予防策とは？—　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Japan, 10, 34, 36, 2011年10月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

現場で活かす酪農技術 牛白血病の感染予防対策 1 牛白血病はなぜ増えたのか?
今内覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Jpn, 56, 11, 53, 55, 2011年09月01日
日本語

牛白血病の感染予防対策 —牛白血病はなぜ増えたのか？—　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairy Japan, 9, 37, 39, 2011年09月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)唾液腺由来免疫抑制因子の同定および発現解析
丹羽彩乃, 今内覚, GITHAKA Naftary, 伊東拓也, 川端寛樹, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 152nd, 207, 2011年08月31日
日本語

マレック病ウイルス強毒株由来Meqおよび弱毒株由来L‐Meqによるbcl‐2遺伝子発現調節の比較
村田史郎, 伊勢崎政美, 松山あゆ美, 高崎紗蘭, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 152nd, 241, 2011年08月31日
日本語

ウシ免疫抑制受容体Tim‐3の同定と牛白血病ウイルス感染牛における発現解析
岡川朋弘, 今内覚, 池渕良洋, 鈴木紗織, 寸田祐嗣, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 152nd, 224, 2011年08月31日
日本語

牛白血病ウイルス感染牛における制御性T細胞の動態解析
鈴木紗織, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 寸田祐嗣, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 152nd, 224, 2011年08月31日
日本語

トリパノソーマ原虫感染において制御性樹状細胞は炎症反応を抑制して病態の改善に関与する
目堅博久, 今内覚, 井上昇, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 152nd, 205, 2011年08月31日
日本語

Theileria parva原虫感染牛属のサイトカイン発現比較解析
今内覚, 岡川朋弘, NAFTALY Githaka, 目堅博久, 鈴木紗織, EDWARD Kariuki, ROBERT Skilton, 石塚真由美, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 152nd, 204, 2011年08月31日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)におけるライム病ボレリア伝播関連因子の同定.
今内覚, 村瀬優介, 伊東拓也, 高野愛, 川端寛樹, 村田史郎, 大橋和彦, 衛生動物, 62, 2, 133, 2011年06月15日
日本語

バイオセキュリティを見直す 4)感染牛を把握し,伝播リスクを抑える ウイルスを原因とする牛白血病の防疫
今内覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, Dairyman, 61, 6, 30, 31, 2011年06月01日
日本語

ウイルスを原因とする牛白血病の防疫（感染牛を把握し、伝播リスクを抑える）　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, DAIRYMAN, 61, 30, 31, 2011年06月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

Molecular detection of Anaplasma phagocytophilum in cattle and Ixodes persulcatus ticks
Yusuke Murase, Satoru Konnai, Arata Hidano, Naftali W. Githaka, Takuya Ito, Ai Takano, Hiroki Kawabata, Manabu Ato, Tomoko Tajima, Motoshi Tajima, Misao Onuma, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi, VETERINARY MICROBIOLOGY, 149, 3-4, 504, 507, 2011年05月
英語

牛の難治性疾病に対する多機能型ワクチン戦略
今内覚, 池渕良洋, 寸田祐嗣, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 151st, 120, 2011年03月01日
日本語

牛末梢血よりTheileria orientalisとBabesia ovataとの混合感染有核細胞培養系の樹立
児玉道, 荻原喜久美, 納屋裕子, 久保正法, 榊原伸一, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 151st, 217, 2011年03月01日
日本語

ベクターコントロールによる東海岸熱新規防除法の探索
山田慎二, 今内覚, 今村彩貴, SIMMUNZA Martin, NANBOTA Andrew, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 151st, 79, 2011年03月01日
日本語

牛白血病の感染防御対策　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 田島誉士, 小沼 操, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道しゃくなげ会会報, 50, 10, 12, 2011年02月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

国内の牛白血病の現状と今後の対策について　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 田島 誉士, 村田 史郎, 大橋 和彦, 牛臨床寄生虫研究会誌, 2, 2, 3, 2011年02月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

Molecular identification and expression analysis of lipocalins from blood feeding taiga tick, Ixodes persulcatus Schulze
Satoru Konnai, Hideto Nishikado, Shinji Yamada, Saiki Imamura, Takuya Ito, Misao Onuma, Shiro Murata, Kazuhiko Ohashi, EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, 127, 2, 467, 474, 2011年02月
英語

獣医学における保全医学の展開―生物多様性と野生動物感染症―マガンなどの野生水禽の疾病抵抗性とマレック病ウイルスの分布
大橋和彦, 松原綾子, 村田史郎, 今内覚, 獣医畜産新報, 1074, 21, 26, 2011年01月01日
日本語

牛白血病の正体と予防を考察する　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, HOLSTEIN MAGAZINE, 505, 4, 7, 2011年01月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

Cross immunity with Haemaphysalis longicornis glutathione S-transferase reduces an experimental Rhipicephalus (Boophilus) microplus infestation
Luis Fernando Parizi, Kiyoko Uemura Utiumi, Saiki Imamura, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, Aoi Masuda, Itabajara da Silva Vaz, EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, 127, 1, 113, 118, 2011年01月
英語

Characterization of CTLA-4, PD-1 and PDL-1 of swamp and riverine type water buffaloes
Claro N. Mingala, Satoru Konnai, Ryoyo Ikebuchi, Kazuhiko Ohashi, COMPARATIVE IMMUNOLOGY MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES, 34, 1, 55, 63, 2011年01月
英語

難治性慢性疾病における免疫疲弊化機序の解明と新規治療法への応用―獣医医療への応用にむけて―
池渕良洋, 今内覚, 寸田祐輔, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日生研たより, 56, 6, 77, 81, 2010年11月01日
日本語

フィリピン共和国で分離したTrypanosoma evansiの病原性比較解析
目堅博久, 今内覚, MINGALA Claro, DARGANTES Alan, 井上昇, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 191, 2010年09月01日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)由来Salp15様因子の性状解析
村瀬優介, 今内覚, 伊藤拓也, 高野愛, 川端寛樹, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 193, 2010年09月01日
日本語

アフリカスイギュウ(Syncerus caffer)のTh1,Th2および炎症性サイトカイン遺伝子の同定
岡川朋弘, 鈴木紗織, 今内覚, GITHAKA Naftali, KARIUKI Edward, GAKUYA Francis, ESTHER Kanduma, 石塚真由美, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 212, 2010年09月01日
日本語

マレック病ウイルス感染鶏における免疫抑制受容体PD‐1とそのリガンドPD‐L1の発現解析
河東あゆ美, 村田史郎, 加納里佳, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 214, 2010年09月01日
日本語

牛白血病ウイルス感染牛における免疫抑制因子PD‐1/PD‐L1の発現解析と機能解析
池渕良洋, 今内覚, 白井達哉, 寸田祐嗣, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 214, 2010年09月01日
日本語

シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)由来Salp16の宿主免疫抑機構解析
今内覚, 肥田野新, 村瀬優介, 伊東拓也, 川端寛樹, 樋口豪起, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 193, 2010年09月01日
日本語

ウシ免疫抑制因子LAG‐3の同定と牛白血病ウイルス感染牛における発現解析
白井達哉, 今内覚, 池渕良洋, 寸田祐嗣, 小沼操, 村田史郎, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 214, 2010年09月01日
日本語

ワクモDermanyssus gallinaeに対する新規防除法開発のためのトランスクリプトーム解析
伊勢崎政美, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 193, 2010年09月01日
日本語

マガンおよび鶏におけるinterferon‐γ遺伝子プロモーター活性の比較解析
松原綾子, 村田史郎, 加納里佳, 橋口知幸, 伊勢崎政美, 河東あゆ美, 小沼操, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 150th, 215, 2010年09月01日
日本語

メガファームにおける取り組み紹介―牛白血病ウイルス感染伝播阻止トライアルの実例―
今内覚, 安富一郎, 田島誉士, 村田史郎, 大橋和彦, 北海道獣医師会雑誌, 54, 8, 378, 2010年08月10日
日本語

難治性慢性疾病における免疫疲弊化機序の解明と新規治療法への応用〜獣医医療への応用に向けて〜　　　　　　　　　　　　　　　
池渕良洋, 今内 覚, 寸田祐嗣, 小沼 操, 村田史郎, 大橋和彦, NIBS Letter, 56, 6, 7, 11, 2010年06月, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

増加傾向にある牛白血病の現状と対策 〜診療現場からの声に対して〜
今内 覚, 田島 誉士, 小沼 操, 村田 史郎, 大橋 和彦, 産業動物臨床医学雑誌, 1, 2, 110, 114, 2010年06月, ［招待有り］
Japanese Society of Large Animal Clinics / Large Animal Clinic Research Association, 日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

Two novel Salp15-like immunosuppressant genes from salivary glands of Ixodes persulcatus Schulze tick
A. Mori, S. Konnai, S. Yamada, A. Hidano, Y. Murase, T. Ito, A. Takano, H. Kawabata, M. Onuma, K. Ohashi, INSECT MOLECULAR BIOLOGY, 19, 3, 359, 365, 2010年06月
英語

Molecular cloning and expression analysis of bovine programmed death-1
Ryoyo Ikebuchi, Satoru Konnai, Yuji Sunden, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, 54, 5, 291, 298, 2010年05月
英語

増加傾向にある牛白血病の現状と対策 〜診療・生産現場からの声に対して〜
今内 覚, 田島 誉士, 小沼 操, 大橋 和彦, 家畜診療, 57, 4, 201, 207, 2010年04月, ［招待有り］
全国農業共済協会, 日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

マガンなどの野生水禽の疾病抵抗性とマレック病ウイルスの分布
大橋和彦, 松原綾子, 村田史郎, 今内覚, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 149th, 198, 2010年
日本語

The detection and characterization of the meq variants of Marek's diseases virus　　　　　　　　　　　　　　　
Ohashi K, Murata S, Okada T, Konnai S, Animal Viruses, 16, 117, 132, 2010年01月, ［査読有り］, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

Molecular detection of trypanosomes in cattle in South America and genetic diversity of Trypanosoma evansi based on expression-site-associated gene 6
Hirohisa Mekata, Satoru Konnai, William H. Witola, Noboru Inoue, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, INFECTION GENETICS AND EVOLUTION, 9, 6, 1301, 1305, 2009年12月
英語

PCR-based detection of blood parasites in cattle and adult Rhipicephalus appendiculatus ticks
Shinji Yamada, Satoru Konnai, Saiki Imamura, Martin Simuunza, Mwelwa Chembensofu, Amos Chota, Andrew Nambota, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, VETERINARY JOURNAL, 182, 2, 352, 355, 2009年11月
英語

Comparative immunogenicity of Haemaphysalis longicornis and Rhipicephalus (Boophilus) microplus calreticulins
Luis Fernando Parizi, Herbert Rech, Carlos Alexandre Sanchez Ferreira, Saiki Imamura, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, Aoi Masuda, Itabajara da Silva Vaz, VETERINARY PARASITOLOGY, 164, 2-4, 282, 290, 2009年10月
英語

Cloning and characterization of Rhipicephalus appendiculatus voraxin alpha and its effect as anti-tick vaccine
Shinji Yamada, Satoru Konnai, Saiki Imamura, Takuya Ito, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, VACCINE, 27, 43, 5989, 5997, 2009年10月
英語

Classification of new BVDV isolates from Philippine water buffalo using the viral E2 region
Claro N. Mingala, Satoru Konnai, Motoshi Tajima, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF BASIC MICROBIOLOGY, 49, 5, 495, 500, 2009年10月
英語

Quantification of water buffalo (Bubalus bubalis) cytokine expression in response to inactivated foot-and-mouth disease (FMD) vaccine
Claro N. Mingala, Satoru Konnai, Fe A. Venturina, Misao Onuma, Kazubliko Ohashi, RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE, 87, 2, 213, 217, 2009年10月
英語

Identification and characterization of antimicrobial peptide, defensin, in the taiga tick, Ixodes persulcatus
Y. Saito, S. Konnai, S. Yamada, S. Imamura, H. Nishikado, T. Ito, M. Onuma, K. Ohashi, INSECT MOLECULAR BIOLOGY, 18, 4, 531, 539, 2009年08月
英語

Effect of vaccination with a recombinant metalloprotease from Haemaphysalis longicornis
Saiki Imamura, Itabajara da Silva Vaz, Satoru Konnai, Shinji Yamada, Chie Nakajima, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, EXPERIMENTAL AND APPLIED ACAROLOGY, 48, 4, 345, 358, 2009年08月
英語

Development and application of a quantitative real-time PCR for the diagnosis of Surra in water buffaloes
Satoru Konnai, Hirohisa Mekata, Claro N. Mingala, Nancy S. Abes, Charito A. Gutierrez, Jesus Rommel V. Herrera, Alan P. Dargantes, William H. Witola, Libertado C. Cruz, Noboru Inoue, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, INFECTION GENETICS AND EVOLUTION, 9, 4, 449, 452, 2009年07月
英語

Development of an anti-tick vaccine to protect cattle against tick-borne transmission of Theileria parva　　　　　　　　　　　　　　　
Saiki Imamura, Satoru Konnai, Chie Nakajima, Shinji Yamada, Yuko Ito, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, Veterinary Immunology and Immunopathology, 128, 278, 279, 2009年05月

Comparative moleculo-immunological analysis of swamp- and riverine-type water buffaloes responses
Claro N. Mingala, Satoru Konnai, Libertado C. Cruz, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, CYTOKINE, 46, 2, 273, 282, 2009年05月
英語

Microarray analysis of host immune responses to Marek’s disease virus infection in vaccinated chickens.
Rika Kano, Satoru Konnai, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, Journal of Veterinary Medical Science, 71, 5, 603, 610, 2009年05月
英語

Expression and activity of glycogen synthase kinase during vitellogenesis and embryogenesis of Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Carlos Logullo, William H. Witola, Caroline Andrade, Leonardo Abreu, Josiana Gomes, Itabajara da Silva Vaz, Saiki Imamura, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, VETERINARY PARASITOLOGY, 161, 3-4, 261, 269, 2009年05月
英語

Cytokine profiles in chickens infected with virulent and avirulent Marek’s disease viruses: interferon-gamma is a key factor in the protection of Marek’s disease by vaccination.
KANO Rika, KONNAI Satoru, ONUMA Misao, OHASHI Kazuhiko, Microbiology and Immunology, 53, 4, 224, 232, 2009年04月
英語

Suppression of cell proliferation and cytokine expression by HL-p36, a tick salivary gland-derived protein of Haemaphysalis longicornis
Satoru Konnai, Chie Nakajima, Saiki Imamura, Shinji Yamada, Hideto Nishikado, Michi Kodama, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, IMMUNOLOGY, 126, 2, 209, 219, 2009年02月
英語

シュルツェマダニにおけるライム病ボレリア伝播関連遺伝子の同定
今内覚, 村瀬優介, 山田慎二, 肥田野新, 伊東拓也, 川端寛樹, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 148th, 2009年

牛白血病ウイルス感染症の現状と対策—清浄化への道、まず新たな感染を防ぐことからー　　　　　　　　　　　　　　　
今内 覚, 田島誉士, 小沼 操, 大橋和彦, 北獣会誌, 53, 9, 529, 534, 2009年, ［招待有り］
日本語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

Quantitative Analysis of Cytokine mRNA Expression and Protozoan DNA Load in Theileria parva-Infected Cattle
Shinji Yamada, Satoru Konnai, Saiki Imamura, Martin Simuunza, Mwelwa Chembensofu, Amos Chota, Andrew Nambota, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 71, 1, 49, 54, 2009年01月
英語

Rhipicephalus appendiculatus: Characterization of a testis-associated protein
Shinji Yamada, Yuko Ito, Saiki Imamura, Satoru Konnai, Takuya Ito, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, 120, 4, 337, 342, 2008年12月
英語

採卵鶏の神経膠腫から分離されたトリ白血病ウイルスの病原性
唯野剛史, 落合謙爾, 畑井仁, 越智章仁, 小桜利恵, 大橋和彦, 寸田祐嗣, 梅村孝司, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 146th, 160, 2008年09月05日
日本語

Theileria parva感染牛に認められた炎症性サイトカインストーム
山田慎二, 今内覚, 今村彩貴, SIMUUNZA Martin, CHEMBENSOFU Mwelwa, AMOS Chota, NAMBOTA Andrew, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 146th, 170, 2008年09月05日
日本語

マレック病ウイルスmeq遺伝子の多型に伴うMeqタンパクの転写活性化能の変化
橋口知幸, 村田史郎, 岡田宰, 加納里佳, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 146th, 189, 2008年09月05日
日本語

Prevalence and Source of Trypanosome Infections in Field-Captured Vector Flies (Glossina pallidipes) in Southeastern Zambia
Hirohisa Mekata, Satoru Konnai, Martin Simuunza, Mwelwa Chembensofu, Rika Kano, William H. Witola, Mwase E. Tembo, Harrison Chitambo, Noboru Inoue, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 70, 9, 923, 928, 2008年09月
英語

Serological survey of Toxoplasma gondii in wild waterfowl in Chukotka, Kamchatka, Russia and Hokkaido, Japan
Takehiro Murao, Yoshitaka Omata, Rika Kano, Shiro Murata, Tsukasa Okada, Satoru Konnai, Mitsuhiko Asakawa, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, JOURNAL OF PARASITOLOGY, 94, 4, 830, 833, 2008年08月
英語

Detection of Trypanosoma brucei in field-captured tsetse flies and identification of host species fed on by the infected flies
Satoru Konnai, Hirohisa Mekata, Raadan Odbileg, Martin Simuunza, Mwelwa Chembensof, William Harold Witola, Mwase Enala Tembo, Harrison Chitambo, Noboru Inoue, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, VECTOR-BORNE AND ZOONOTIC DISEASES, 8, 4, 565, 573, 2008年08月
英語

Effects of anti-tick cocktail vaccine against Rhipicephalus appendiculatus
Saiki Imamura, Satoru Konnai, Itabajara da Silva Vaz Junior, Shinji Yamada, Chie Nakajima, Yuko Ito, Tomoko Tajima, Jun Yasuda, Martin Simuunza, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 56, 2, 85, 98, 2008年08月
英語

Prevalence of fowl glioma-inducing virus in chickens of zoological gardens in Japan and nucleotide variation in the env gene
Hitoshi Hatai, Kenji Ochiai, Mariko Murakami, Syunsuke Imanishi, Yukiko Tomioka, Takeshi Toyoda, Kazuhiko Ohashi, Takashi Umemura, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 70, 5, 469, 474, 2008年05月
英語

神経系に腫瘍原性を持つトリレトロウイルスの疫学的検索
越智章仁, 落合謙爾, 畑井仁, 唯野剛史, 大橋和彦, 梅村孝司, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 145th, 174, 2008年03月07日
日本語

A survey of abortifacient infectious agents in livestock in Luzon, the Philippines, with emphasis on the situation in a cattle herd with abortion problems
Satoru Konnai, Claro N. Mingala, Misako Sato, Nancy S. Abes, Fe A. Venturina, Charito A. Gutierrez, Takafumi Sano, Yoshitaka Omata, Libertado C. Cruz, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, ACTA TROPICA, 105, 3, 269, 273, 2008年03月
英語

Cytokine responses in camels (Camelus bactrianus) vaccinated with Brucella abortus strain 19 vaccine
Raadan Odbileg, Byambaa Purevtseren, Dorj Gantsetseg, Bazartseren Boldbaatar, Tumurjav Buyannemekh, Zagd Galmandakh, Janchivdorj Erdenebaatar, Satoru Konnai, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 70, 2, 197, 201, 2008年02月
英語

弱毒および強毒株マレック病ウイルス感染鶏における免疫応答の比較
加納里佳, 橋口知幸, 岡田宰, 村田史郎, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本ウイルス学会北海道支部夏季シンポジウム講演抄録, 42nd, 14, 2008年
日本語

Establishment of a laboratory colony of taiga tick Ixodes persulcatus for tick-borne pathogen transmission studies
Satoru Konnai, Yoichi Saito, Hideto Nishikado, Shinji Yamada, Saiki Imamura, Akina Mori, Takuya Ito, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 55, 2-3, 85, 92, 2008年01月
英語

A recombinant avian leukosis virus associated with fowl glioma in layer chickens in Japan
Hitoshi Hatai, Kenji Ochiai, Katsue Nagakura, Syunsuke Imanishi, Akihiro Ochi, Rie Kozakura, Masaaki Ono, Masanobu Goryo, Kazuhiko Ohashi, Takashi Umemura, AVIAN PATHOLOGY, 37, 2, 127, 137, 2008年
英語

帯広近郊,ロシアならびにカムチャッカにおける野生水禽類のToxoplasma gondii抗体保有状況
村尾岳洋, 加納里佳, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 小沼操, 前田龍一郎, 小俣吉孝, 日本野生動物医学会大会・講演要旨集, 13th, 88, 2007年09月06日
日本語

Development of a nested polymerase chain reaction method to detect oncogenic Marek's disease virus from feather tips
Shiro Murata, Kyung-Soo Chang, Sung-Il Lee, Satoru Konnai, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF VETERINARY DIAGNOSTIC INVESTIGATION, 19, 5, 471, 478, 2007年09月
英語

コイタマダニにおけるオスダニ由来因子の同定と発現解析
山田慎二, 今村彩貴, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 69, 2007年08月27日
日本語

コイタマダニ由来新規シスタチン遺伝子のクローニングと性状解析
今村彩貴, 山田慎二, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 69, 2007年08月27日
日本語

シュルツェマダニ由来defensin遺伝子のクローニングおよび発現解析
斉藤洋一, 今内覚, 西門秀人, 山田慎二, 今村彩貴, 森亜紀奈, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 67, 2007年08月27日
日本語

マレック病ウイルス弱毒株由来L‐Meqと強毒株由来Meqの機能における比較解析
村田史郎, 岡田宰, 加納里佳, 小沼操, 今内覚, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 83, 2007年08月27日
日本語

弱毒および強毒マレック病ウイルス感染鶏における免疫応答の比較
加納里佳, 村田史郎, 岡田宰, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 77, 2007年08月27日
日本語

帯広近郊,ロシアならびにカムチャッカにおける野生カモ類のトキソプラズマ抗体保有状況
村尾岳洋, 加納里佳, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 小沼操, 前田龍一郎, 小俣吉孝, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 65, 2007年08月27日
日本語

マレック病ウイルス発癌遺伝子meqのスプライス産物Δmeqの発現・性状解析
岡田宰, 村田史郎, 加納里佳, 高木道浩, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 144th, 83, 2007年08月27日
日本語

Detection of the virulent Marek's disease virus genome from feather tips of wild geese in Japan and the Far East region of Russia
S. Murata, K.-S. Chang, Y. Yamamoto, T. Okada, S.-I. Lee, S. Konnai, M. Onuma, Y. Osa, M. Asakawa, K. Ohashi, ARCHIVES OF VIROLOGY, 152, 8, 1523, 1526, 2007年08月
英語

Identification and characterization of a novel spliced form of the meq transcript in lymphoblastoid cell lines derived from Marek's disease tumours
Tsukasa Okada, Michihiro Takagi, Shiro Murata, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, 88, 8, 2111, 2120, 2007年08月
英語

Attachment duration required for Rhipicephalus appendiculatus to transmit Theileria parva to the host
Satoru Konnai, Shinji Yamada, Saiki Imamura, Martin Simuunza, Mwelwa Chembensof, Amos Chota, Andrew Nambota, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 7, 2, 241, 248, 2007年06月
英語

Interferon-gamma expression associated with suppression of bovine leukemia virus at the early phase of infection in sheep
Tatsufumi Usui, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, 23, 4, 609, 609, 2007年04月
英語, 研究発表ペーパー・要旨（国際会議）

Tumor necrosis factor-alpha genetic polymorphism may contribute to progression of bovine leukemia virus infection
Satoru Konnai, Tatsufumi Usui, Manabu Ikeda, Junko Kohara, Kosuke Okada, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, 23, 4, 608, 609, 2007年04月
英語, 研究発表ペーパー・要旨（国際会議）

Molecular cloning, sequencing and phylogenetic analysis of inflammatory cytokines of swamp type buffalo contrasting with other bubaline breeds
Claro N. Mingala, Raadan Odbileg, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, COMPARATIVE IMMUNOLOGY MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES, 30, 2, 119, 131, 2007年03月
英語

Interferon-gamma expression associated with suppression of bovine leukemia virus at the early phase of infection in sheep
Tatsufumi Usui, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 115, 1-2, 17, 23, 2007年01月
英語

Comparative assessment of Th1 and Th2 cytokines of swamp type buffalo and other bubaline breeds by molecular cloning, sequencing and phylogenetics
Claro N. Mingala, Raadan Odbileg, Satoru Konnal, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 113, 3-4, 348, 356, 2006年10月
英語

Complete cDNA sequences and phylogenetic analyses of the Th1 and Th2 cytokines of the bactrian camel (Camelus bactrianus)
Raadan Odbileg, Byambaa Purevtseren, Zayat Batsukh, Satoru Konnaii, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 68, 9, 941, 946, 2006年09月
英語

Theileria parva感染Rhipicephalus appendiculatusによる宿主への実験的伝播
今内覚, 山田慎二, 今村彩貴, MARTIN Simuunza, MWELWA Chembensofu, ANDREW Nambota, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 142nd, 67, 2006年08月31日
日本語

マレック病由来腫瘍細胞株におけるMeqバリアント(変異体)の機能解析
岡田宰, 高木道浩, 村田史郎, 加納里佳, 林裕子, 今内覚, 小沼操, 大橋和彦, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 142nd, 80, 2006年08月31日
日本語

マレック病ウイルスの強毒化とmeq遺伝子の多型との関連
村田史郎, 岡田宰, 加納里佳, 林裕子, 今内覚, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 142nd, 80, 2006年08月31日
日本語

The presence of the p53 transcripts with truncated open reading frames in Marek’s disease tumor-derived cell lines.
Michihiro Takagi, Kazuhiko Ohashi, Toshifumi Morimura, Chihiro Sugimoto, Misao Onuma, Leukemia Research, 30, 8, 987, 992, 2006年08月
英語

Expression of tumor necrosis factor-alpha in IgM(+) B-cells from bovine leukemia virus-infected lymphocytotic sheep
Tatsufumi Usui, Satoru Konnai, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 112, 3-4, 296, 301, 2006年08月
英語

Acquisition and transmission of Theileria parva by vector tick, Rhipicephalus appendiculatus
Satoru Konnai, Saiki Imamura, Chie Nakajima, William Harold Witola, Shinji Yamada, Martin Simuunza, Andrew Nambota, Jun Yasuda, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, ACTA TROPICA, 99, 1, 34, 41, 2006年08月
英語

Tumor necrosis factor-alpha genetic polymorphism may contribute to progression of bovine leukemia virus-infection
Satoru Konnai, Tatsufumi Usui, Manabu Ikeda, Junko Kohara, Toh-ichi Hirata, Kosuke Okada, Kazuhiko Ohashi, Misao Onuma, MICROBES AND INFECTION, 8, 8, 2163, 2171, 2006年07月
英語

The effect of TAO expression on PCD-like phenomenon development and drug resistance in Trypanosoma brucei
A Tsuda, WH Witola, S Konnai, K Ohashi, M Onuma, PARASITOLOGY INTERNATIONAL, 55, 2, 135, 142, 2006年06月
英語

The presence of a short form of p53 in chicken lymphoblastoid cell lines during apoptosis
Michihiro Takagi, Tamami Takeda, Yuki Asada, Chihiro Sugimoto, Misao Onuma, Kazuhiko Ohashi, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 68, 6, 561, 566, 2006年06月
英語

A novel gene encoding a thrombin inhibitory protein in a cDNA library from Haemaphysalis longicornis salivary gland
C Nakajima, S Imamura, S Konnai, S Yamada, H Nishikado, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 68, 5, 447, 452, 2006年05月
英語

Two serine protease inhibitors (serpins) that induce a bovine protective immune response against Rhipicephalus appendiculatus ticks
S Imamura, B Namangala, T Tajima, ME Tembo, J Yasuda, K Ohashi, M Onuma, VACCINE, 24, 13, 2230, 2237, 2006年03月
英語

Tumor necrosis factor-alpha up-regulation in spontaneously proliferating cells derived from bovine leukemia virus-infected cattle
S Konnai, T Usui, M Ikeda, J Kohara, T Hirata, K Okada, K Ohashi, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 151, 2, 347, 360, 2006年02月
英語

Expression of alternative oxidase inhibits programmed cell death-like phenomenon in bloodstream form of Trypanosoma brucei rhodesiense
A Tsuda, WH Witola, K Ohashi, M Onuma, PARASITOLOGY INTERNATIONAL, 54, 4, 243, 251, 2005年12月
英語

Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus by real-time PCR with melting-curve analysis
HM Pham, S Konnai, T Usui, KS Chang, S Murata, M Mase, K Ohashi, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 150, 12, 2429, 2438, 2005年12月
英語

Nested polymerase chain reaction for detection of the avian leukosis virus causing so-called fowl glioma
H Hatai, K Ochiai, Y Tomioka, T Toyoda, K Hayashi, M Anada, M Kato, A Toda, K Ohashi, E Ono, T Kimura, T Umemura, AVIAN PATHOLOGY, 34, 6, 473, 479, 2005年12月
英語

Identification and characterization of peptides binding to Newcastle disease virus by phage display
M Ozawa, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 67, 12, 1237, 1241, 2005年12月
英語

Theileria orientalis: Cloning a cDNA encoding a protein similar to thiol protease with haemoglobin-binding activity
WY He, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, 111, 3, 143, 153, 2005年11月
英語

Acquired resistance to berenil in a cloned isolate of Trypanosoma evansi is associated with upregulation of a novel gene, TeDR40
WH Witola, A Tsuda, N Inoue, K Ohashi, M Onuma, PARASITOLOGY, 131, 635, 646, 2005年11月
英語

Random sequencing of cDNA library derived from partially-fed adult female Haemaphysalis longicornis salivary gland
C Nakajima, ID Vaz, S Imamura, S Konnai, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 67, 11, 1127, 1131, 2005年11月
英語

Imbalance of tumor necrosis factor receptors during progression in bovine leukemia virus infection
S Konnai, T Usui, M Ikeda, J Kohara, T Hirata, K Okada, K Ohashi, M Onuma, VIROLOGY, 339, 2, 239, 248, 2005年09月
英語

Molecular cloning and phylogenetic analysis of inflammatory cytokines of Camelidae (llama and camel)
R Odbileg, S Konnai, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 67, 9, 921, 925, 2005年09月
英語

コイタマダニ由来セルピンの抗ダニカクテルワクチン効果
今村彩貴, BONIFACE Mamangala, 今内覚, 中島千絵, MWASE Tembo, 田島朋子, 安田準, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 140th, 84, 2005年08月31日
日本語

コイタマダニにおける精巣由来オス因子の探索
伊藤裕子, 今内覚, 今村彩貴, 中島千絵, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 140th, 79, 2005年08月31日
日本語

フタトゲチマダニ由来新規メタロプロテアーゼ遺伝子のクローニングと性状解析
今村彩貴, 今内覚, 中島千絵, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 140th, 78, 2005年08月31日
日本語

ザンビア共和国における牛およびRhipicephalus appendiculatusからのTheileria parvaの検出
今内覚, 今村彩貴, 中島千絵, SIMUNZA Martin, AMOS Chota, CHEMBENSOFU Mwelwa, ANDOREU Nambota, 安田準, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 140th, 84, 2005年08月31日
日本語

鶏およびマガン由来マレック病ウイルスの遺伝子解析とその比較
村田史郎, 山本裕己, 岡田宰, 浅川満彦, 長雄一, 池内俊雄, 今内覚, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 140th, 108, 2005年08月31日
日本語

Detection of the meq gene in the T cell subsets from chickens infected with Marek’s disease virus serotype 1.
KS Chang, K Ohashi, SI Lee, M Takagi, M Onuma, Japanese Journal of Veterinary Research, 53, 1-2, 3, 11, 2005年08月
英語

Ability of orally administered IFN-alpha-containing transgenic potato extracts to inhibit Listeria monocytogenes infection
K Ohya, T Matsumura, N Itchoda, K Ohashi, M Onuma, C Sugimoto, JOURNAL OF INTERFERON AND CYTOKINE RESEARCH, 25, 8, 459, 466, 2005年08月
英語

Cloning and characterization of cDNA encoding a prohibitin-like protein from Theileria orientalis
WY He, K Ohashi, C Sugimoto, M Tsuji, M Onuma, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 53, 1-2, 27, 35, 2005年08月
英語

Cloning and sequence analysis of llama (lama glama) Th2 (IL-4, IL-10 and IL-13) cytokines
R Odbileg, SI Lee, K Ohashi, M Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 104, 3-4, 145, 153, 2005年04月
英語

Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus
HM Pham, C Nakajima, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 43, 4, 1646, 1650, 2005年04月
英語

Multiple perineuriomas in chicken (Gallus gallus domesticus)
T Toyoda, K Ochiai, K Ohashi, Y Tomioka, T Kimura, T Umemura, VETERINARY PATHOLOGY, 42, 2, 176, 183, 2005年03月
英語

Relationship of bovine viral diarrhea virus persistent infection to incidence,of diseases on dairy farms based on bulk tank milk test by RT-PCR
T Kozasa, M Tajima, Yasutomi, I, K Sano, K Ohashi, M Onuma, VETERINARY MICROBIOLOGY, 106, 1-2, 41, 47, 2005年03月
英語

Quantification of llama inflammatory cytokine mRNAs by real-time RT-PCR
R Odbileg, S Konnai, T Usui, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 67, 2, 195, 198, 2005年02月
英語

Molecular cloning and sequence analysis of cDNAs encoding for Boophilus microplus, Haemaphysalis longicornis and Rhipicephalus appendiculatus actins
ID Vaz, S Imamura, C Nakajima, FC de Cardoso, CAS Ferreira, G Renard, A Masuda, K Ohashi, N Onuma, VETERINARY PARASITOLOGY, 127, 2, 147, 155, 2005年01月
英語

A serine protease inhibitor (serpin) from Haemaphysalis longicornis as an anti-tick vaccine
S Imamura, ID Vaz, M Sugino, K Ohashi, M Onuma, VACCINE, 23, 10, 1301, 1311, 2005年01月
英語

Genetic variability in ESAG6 genes among Trypanosoma evansi isolates and in comparison to other Trypanozoon members
WH Witola, N Sarataphan, N Inoue, K Ohashi, M Onuma, ACTA TROPICA, 93, 1, 63, 73, 2005年01月
英語

Cloning and sequence analysis of llama cytokines related to cell-mediated immunity (vol 99, pg 1, 2004)
R Odbileg, SI Lee, R Yoshida, KS Chang, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 102, 1-2, 91, +, 2004年11月
英語, その他

発現遺伝子解析によるダニ由来有用物質の探索
中島千絵, 今村彩貴, 今内覚, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 138th, 65, 2004年08月01日
日本語

Molecular characterization of the nucleocapsid protein gene of Newcastle disease virus strains in Japan and development of a restriction enzyme-based rapid identifying method
HM Pham, KS Chang, M Mase, K Ohashi, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 149, 8, 1559, 1569, 2004年08月
英語

見えてきたウイルス発癌 マレック病ウイルスによる潜伏感染・腫よう化におけるL‐meq遺伝子の役割
大橋和彦, CHANG K‐S, LEE S‐I, 村田史郎, 高木道浩, 小沼操, 獣医畜産新報, 996, 594, 595, 2004年07月01日
日本語

Cloning, expression and partial characterization of a Haemaphysalis longicornis and a Rhipicephalus appendiculatus glutathione S-transferase
ID Vaz, S Imamura, K Ohashi, M Onuma, INSECT MOLECULAR BIOLOGY, 13, 3, 329, 335, 2004年06月
英語

RNA-interference silencing of the adenosine transporter-1 gene in Trypanosoma evansi confers resistance to diminazene aceturate
WH Witola, N Inoue, K Ohashi, M Onuma, EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, 107, 1-2, 47, 57, 2004年05月
英語

Evidence for bovine immunodeficiency virus infection in cattle in Zambia
S Meas, M Nakayama, T Usui, Y Nakazato, J Yasuda, K Ohashi, M Onuma, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 52, 1, 3, 8, 2004年05月
英語

マレック病ウイルスによる潜伏感染・腫よう化におけるL‐meq遺伝子の役割
大橋和彦, CHANG K‐S, LEE S‐I, 村田史郎, 高木道浩, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 137th, 86, 2004年03月01日
日本語

Genome sequence analysis of the avian retrovirus causing so-called fowl glioma and the promoter activity of the long terminal repeat
Y Tomioka, K Ochiai, K Ohashi, E Ono, T Toyoda, T Kimura, T Umemura, JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, 85, 3, 647, 652, 2004年03月
英語

バルク乳中抗体の検出による牛ウイルス性下痢ウイルスの浸潤状況調査
小佐々 隆志, 田島 誉士, 佐野 公洋, 安富 一郎, 大橋 和彦, 小沼 操, 日本獣医師会雑誌, 57, 11, 705, 709, 2004年
北海道の2地区196軒の酪農家からのバルク乳の乳清を用いたウィルス中和試験により、牛ウィルス性下痢ウィルス（BVDV）の浸潤状況を調査した。検査対象とした2地区は、バルク乳からBVDV遺伝子が検出されたA地区151軒と検出されなかったB地区45軒である。検査の結果、BVDV遺伝子検出の有無にかかわらず166軒（166/196＝84.7％）の酪農家の検体が16倍以上の中和抗体価を示した。また、そのうち疫学情報の入手が可能であった132軒中、64軒（48.5％）では過去にBVDV感染が摘発されたことがなく、ワクチン接種歴もなく、かつ自家生産牛のみの牛群であった。以上からこれらの地区には、感染経路は不明であるかBVDVが広く浸潤していることが明らかとなり、本感染症を牛群から清浄化するためには長期的な監視が必要であると考えられた。, 日本獸医師会, 日本語

臨床症状を指標とした牛ウイルス性下痢ウイルスの汚染状況調査
日本獣医師会雑誌, 57, 511, 514, 2004年

In ovo infection with an avian leukosis virus causing fowl glioma: viral distribution and pathogenesis
Y Tomioka, K Ochiai, K Ohashi, T Kimura, T Umemura, AVIAN PATHOLOGY, 32, 6, 617, 624, 2003年12月
英語

Protective effects of vaccination with bovine leukemia virus (BLV) tax DNA against BLV infection in sheep
T Usui, S Konnai, S Tajima, S Watarai, Y Aida, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 65, 11, 1201, 1205, 2003年11月
英語

マレック病ウイルス感染鶏の羽材料からのmeq遺伝子の検出
村田史郎, CHANG K‐S, LEE S‐I, 大橋和彦, 小沼操, 日本獣医学会学術集会講演要旨集, 136th, 135, 2003年09月10日
日本語

Production and characterization of monoclonal antibodies against midgut of ixodid tick, Haemaphysalis longicornis
M Nakajima, M Kodama, H Yanase, T Iwanaga, A Mulenga, K Ohashi, M Onuma, VETERINARY PARASITOLOGY, 115, 4, 355, 363, 2003年08月
英語

The rapid quantitative analysis of bovine cytokine genes by real-time RT-PCR
S Konnai, T Usui, K Ohashi, M Onuma, VETERINARY MICROBIOLOGY, 94, 4, 283, 294, 2003年07月
英語

A serine proteinase inhibitor (serpin) from ixodid tick Haemaphysalis longicornis; cloning and preliminary assessment of its suitability as a candidate for a tick vaccine
M Sugino, S Imamura, A Mulenga, M Nakajima, A Tsuda, K Ohashi, M Onuma, VACCINE, 21, 21-22, 2844, 2851, 2003年06月
英語

Evidence of bovine immunodeficiency virus in cattle in Turkey
S Meas, Z Yilmaz, T Usui, S Torun, K Yesilbag, K Ohashi, M Onuma, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 51, 1, 3, 8, 2003年05月
英語

cDNA cloning of a Rab5 homologue in Babesia gibsoni
JL Zhou, K Ohashi, M Yamasaki, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 65, 4, 519, 521, 2003年04月
英語

Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in dairy and beef cattle in Hokkaido
T Usui, S Meas, S Konnai, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 65, 2, 287, 289, 2003年02月
英語

Passive immunization with monoclonal antibodies: effects on Haemaphysalis longicornis tick infestation of BALB/c mice
M Nakajima, H Yanase, T Iwanaga, M Kodama, K Ohashi, M Onuma, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 50, 4, 157, 163, 2003年02月
英語

Diversity (polymorphism) of the meq gene in the attenuated Marek's disease virus (MDV) serotype 1 and MDV-transformed cell lines
KS Chang, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 64, 12, 1097, 1101, 2002年12月
英語

Suppression of transcription activity of the MEQ protein of oncogenic Marek's disease virus serotype 1 (MDV1) by L-MEQ of non-oncogenic MDV1
KS Chang, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 64, 12, 1091, 1095, 2002年12月
英語

Seroprevalence and molecular evidence for the presence of bovine immunodeficiency virus in Brazilian cattle (vol 50, pg 9, 2002)
S Meas, J Ruas, NA Farias, T Usui, Y Teraoka, A Mulenga, KS Chang, A Masuda, CR Madruga, K Ohashi, M Onuma, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 50, 2-3, 145, 145, 2002年11月
英語, その他

Babesia gibsoni: molecular cloning and characterization of Rab6 and Rab11 homologues
JL Zhou, A Mulenga, M Yamasaki, K Ohashi, Y Maede, M Onuma, EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, 101, 4, 210, 214, 2002年08月
英語

The detection of the meq gene in chicken infected with Marek's disease virus serotype 1
KS Chang, SI Lee, K Ohashi, A Ibrahim, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 64, 5, 413, 417, 2002年05月
英語

Nonsuppurative myocarditis associated with so-called fowl glioma
N Iwata, K Ochiai, K Hayashi, K Ohashi, T Umemura, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 64, 5, 395, 399, 2002年05月
英語

Avian retrovirus infection causes naturally occurring glioma: Isolation and transmission of a virus from so-called fowl glioma
N Iwata, K Ochiai, K Hayashi, K Ohashi, T Umemura, AVIAN PATHOLOGY, 31, 2, 193, 199, 2002年04月
英語

Expression of biologically active human tumor necrosis factor-alpha in transgenic potato plant
K Ohya, N Itchoda, K Ohashi, M Onuma, C Sugimoto, T Matsumura, JOURNAL OF INTERFERON AND CYTOKINE RESEARCH, 22, 3, 371, 378, 2002年03月
英語

Biological and pathological studies on Marek’s disease virus (strains Md5 and CVI988C/R6) using polymerase chain reaction (PCR).　　　　　　　　　　　　　　　
1st International Science Conference of Faculty of Veterinary Medicine, 1, 13, 2002年

The L-meq gene detected in chicken cells infected with Marek's disease virus serotype 1.　　　　　　　　　　　　　　　
1st International Science Conference of Faculty of Veterinary Medicine, 21, 26, 2002年

Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in dairy cattle herds
S Meas, T Usui, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, VETERINARY MICROBIOLOGY, 84, 3, 275, 282, 2002年01月
英語

北海道宮島沼におけるマレック病感染マガン
酪農大野生動物医学グループ, 富川 徹, 大橋 和彦, 小沼 操, Zoo and wildlife news = ズー・アンド・ワイルドライフニュース, 13, 28, 29, 2001年12月01日
日本野生動物医学会, 日本語

Survey of Theileria parasite infection in cattle in Cambodia and Vietnam using piroplasm surface protein gene-specific polymerase chain reaction
M Inoue, D Van Nguyen, S Meas, K Ohashi, S Sen, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 63, 10, 1155, 1157, 2001年10月
英語

Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato plants
K Ohya, T Matsumura, K Ohashi, M Onuma, C Sugimoto, JOURNAL OF INTERFERON AND CYTOKINE RESEARCH, 21, 8, 595, 602, 2001年08月
英語

Tumor necrosis factor alpha and its receptors in experimentally bovine leukemia virus-infected sheep
H Kabeya, A Fukuda, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 81, 1-2, 129, 139, 2001年08月
英語

cDNA cloning, characterization and vaccine effect analysis of Haemaphysalis longicornis tick saliva proteins
A Tsuda, A Mulenga, C Sugimoto, M Nakajima, K Ohashi, M Onuma, VACCINE, 19, 30, 4287, 4296, 2001年07月
英語

Characterization of two cDNAs encoding serine proteinases from the hard tick Haemaphysalis longicornis
A Mulenga, C Sugimoto, G Ingram, K Ohashi, O Misao, INSECT BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, 31, 8, 817, 825, 2001年06月
英語

Heparin inhibits plaque formation by cell-free Marek's disease viruses in vitro
SI Lee, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 63, 4, 427, 432, 2001年04月
英語

Identification of new deleted forms of the p53 transcripts and their products in Marek's disease lymphoblastoid cell lines
M Takagi, K Ohashia, T Takeda, Y Asada, Y Wakita, C Sugimoto, M Onuma, J Kawano, R Osawa, A Shimizu, CURRENT PROGRESS ON MAREK'S DISEASE RESEARCH, 305, 312, 2001年
英語

The kinetic changes of lymphocyte populations and cytokine profiles in chickens genetically susceptible and resistant to Marek's disease
K Ohashi, Y Maeda, SI Lee, M Mizutani, C Sugimoto, M Onuma, CURRENT PROGRESS ON MAREK'S DISEASE RESEARCH, 295, 301, 2001年
英語

Phylogenetic relationships of bovine immunodeficiency virus in cattle and buffaloes based on surface envelope gene sequences
S Meas, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 146, 5, 1037, 1045, 2001年
英語

Insertion of a 178-BP sequence into the meq gene of Marek's disease virus serotype 1
SI Lee, K Ohashi, M Takagi, KS Chang, C Sugimoto, M Onuma, CURRENT PROGRESS ON MAREK'S DISEASE RESEARCH, 289, 294, 2001年
英語

Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in draught animals in Cambodia
S Meas, K Ohashi, S Tum, M Chhin, K Te, K Miura, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 62, 7, 779, 781, 2000年07月
英語

Characterization of an 84 kDa protein inducing an immediate hypersensitivity reaction in rabbits sensitized to Haemaphysalis longicornis ticks
A Mulenga, C Sugimoto, K Ohashi, M Onuma, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-MOLECULAR BASIS OF DISEASE, 1501, 2-3, 219, 226, 2000年06月
英語

Infection of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in water buffalo and cattle populations in Pakistan
S Meas, J Seto, C Sugimoto, M Bakhsh, M Riaz, T Sato, K Naeem, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 62, 3, 329, 331, 2000年03月
英語

Difference in the meq gene between oncogenic and attenuated strains of Marek's disease virus serotype 1
SI Lee, M Takagi, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 62, 3, 287, 292, 2000年03月
英語

Differences in the kinetic changes of lymphocyte populations and cytokine profiles between chickens genetically susceptible and resistant to Marek's disease.　　　　　　　　　　　　　　　
Proceedings of the International Veterinary Cytokine and Vaccine Conference, 318, 321, 2000年

Involovement of tumor necrosis factor a in the pathogenesis of bovine leukemia virus infection.　　　　　　　　　　　　　　　
Proceedings of the International Veterinary Cytokine and Vaccine Conference, 155, 158, 2000年

Expression of biologically active molecules in transgenic potatoes.　　　　　　　　　　　　　　　
Proceedings of the International Veterinary Cytokine and Vaccine Conference, 116, 119, 2000年

Tick saliva proteins interacting with the host immune response factors.　　　　　　　　　　　　　　　
Proceedings of the International Veterinary Cytokine and Vaccine Conference, 93, 96, 2000年

Electron microscopic and immunohistochemical localization of Marek's disease (MD) herpesvirus particles in MD skin lymphomas
KO Cho, K Ohashi, M Onuma, VETERINARY PATHOLOGY, 36, 4, 314, 320, 1999年07月
英語

Evidence of neoplastic nature and viral aetiology of so-called fowl glioma
K Ochiai, K Ohashi, T Mukai, T Kimura, T Umemura, C Itakura, VETERINARY RECORD, 145, 3, 79, 81, 1999年07月
英語

Up-regulation of tumor necrosis factor alpha mRNA is associated with bovine-leukemia virus (BLV) elimination in the early phase of infection
H Kabeya, K Ohashi, N Oyunbileg, Y Nagaoka, Y Aida, C Sugimoto, Y Yokomizo, M Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 68, 2-4, 255, 265, 1999年05月
英語

Characterization of immune responses caused by bovine leukemia virus envelope peptides in sheep
H Kabeya, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 61, 5, 475, 480, 1999年05月
英語

Molecular cloning of two Haemaphysalis longicornis cathepsin L-like cysteine proteinase genes
A Mulenga, C Sugimoto, G Ingram, K Ohashi, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 61, 5, 497, 502, 1999年05月
英語

Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus in dairy and beef cattle herds in Korea
KO Cho, S Meas, NY Park, YH Kim, YK Lim, D Endoh, SI Lee, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 61, 5, 549, 551, 1999年05月
英語

Molecular characterization of a Haemaphysalis longicornis tick salivary gland-associated 29-kilodalton protein and its effect as a vaccine against tick infestation in rabbits
A Mulenga, C Sugimoto, Y Sako, K Ohashi, A Musoke, M Shubash, M Onuma, INFECTION AND IMMUNITY, 67, 4, 1652, 1658, 1999年04月
英語

Expression of bcl-2 and bcl-x genes in lymphocytes and tumor cell lines derived from MDV-infected chickens
K Ohashi, T Morimura, M Takagi, SI Lee, KO Cho, H Takahashi, Y Maeda, C Sugimoto, M Onuma, ACTA VIROLOGICA, 43, 2-3, 128, 132, 1999年04月
英語

Bovine leukaemia virus envelope peptides cause immunomodulation in BALB/c mice
H Kabeya, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 68, 1, 39, 48, 1999年03月
英語

Anti-viral and anti-tumor effects induced by an attenuated Marek's disease virus in CD4-or CD8-deficient chickens
T Morimura, KO Cho, Y Kudo, Y Hiramoto, K Ohashi, M Hattori, C Sugimoto, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 144, 9, 1809, 1818, 1999年
英語

Re-isolation of Marek's disease virus from T cell subsets of vaccinated and non-vaccinated chickens
SI Lee, K Ohashi, T Morimura, C Sugimoto, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 144, 1, 45, 54, 1999年
英語

Seroprevalence and field isolation of bovine immunodeficiency virus
S Meas, H Kabeya, S Yoshihara, K Ohashi, S Matsuki, Y Mikami, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 60, 11, 1195, 1202, 1998年11月
英語

Analysis of tumor suppressor gene p53 in chicken lymphoblastoid tumor cell lines and field tumors
M Takagi, K Ohashi, T Morimura, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 60, 8, 923, 929, 1998年08月
英語

Cytology of feather pulp lesions from Marek's disease (MD) virus-infected chickens and its application for diagnosis and prediction of MD
KO Cho, NY Park, D Endoh, K Ohashi, C Sugimoto, C Itakura, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 60, 7, 843, 847, 1998年07月
英語

Epitope mapping of bovine leukemia virus transactivator protein tax
N Sakakibara, H Kabeya, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 60, 5, 599, 605, 1998年05月
英語

Expression and characterization of dog CYP2D15 using Baculovirus expression system
T Tasaki, A Nakamura, S Itoh, K Ohashi, Y Yamamoto, M Masuda, H Iwata, A Kazusaka, T Kamataki, S Fujita, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 123, 1, 162, 168, 1998年01月
英語

Laboratory of Infectious Diseases (An Introduction of the four Departments composing the Graduate Scholl of Veterinary Medicine, Hokkaido University (2))
ONUMA Misao, SUGIMOTO Chihiro, OHASHI Kazuhiko, Japanese journal of veterinary research, 45, 3, 172, 173, 1997年11月28日
北海道大学, 英語

マレック病ウイルスによる腫瘍化とアポトーシス 相反する現象に発癌遺伝子 bcl-2 ファミリーが関与
大橋 和彦, 守村 敏史, 高木 道浩, 杉本 千尋, 小沼 操, 化学と生物, 35, 11, 748, 750, 1997年11月25日
学会出版センタ-, 日本語

Apoptosis in peripheral CD4＋ T cells and thymocytes by Marek's disease virus-infection.　　　　　　　　　　　　　　　
Leukemia, 11 Supplement 3, 206, 208, 1997年

A hypervariable region in VP1 of chicken infectious anemia virus mediates rate of spread and cell tropism in tissue culture
RW Renshaw, C Soine, T Weinkle, PH OConnell, K Ohashi, S Watson, B Lucio, S Harrington, KA Schat, JOURNAL OF VIROLOGY, 70, 12, 8872, 8878, 1996年12月
英語

Immunomodulative effects of bovine immunodeficiency-like virus (BIV)-infection and mixed infection of BIV and bovine leukemia virus on sheep
N Hirai, H Kabeya, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 44, 3, 153, 163, 1996年12月
英語

An effective peptide vaccine to eliminate bovine leukaemia virus (BLV) infested cells in carrier sheep
H Kabeya, K Ohashi, K Ohishi, C Sugimoto, H Amanuma, M Onuma, VACCINE, 14, 12, 1118, 1122, 1996年08月
英語

Detection of antibodies against bovine immunodeficiency-like virus in daily cattle in Hokkaido
N Hirai, H Kabeya, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 58, 5, 455, 457, 1996年05月
英語

Re-isolation of Marek's disease virus from T cell subsets of vaccinated and nonvaccinated chickens
Y Hiramoto, SI Lee, T Morimura, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, CURRENT RESEARCH ON MAREK'S DISEASE, 130, 135, 1996年
英語

Apoptosis of CD４＋ T cell in vivo and non-responsiveness of CD４＋ and CD８＋ T cells in vitro observed in chickens infected with Marek's disease virus.
T Morimura, K Ohashi, M Hattori, C Sugimoto, M Onuma, Current Research on Marek's Disease, 335, 340, 1996年
英語

Apoptosis and CD8-down-regulation in the thymus of chickens infected with Marek's disease virus - Brief report
T Morimura, K Ohashi, Y Kon, M Hattori, C Sugimoto, M Onuma, ARCHIVES OF VIROLOGY, 141, 11, 2243, 2249, 1996年
英語

Characterization of extrathymic T cells of chickens
H Yamamoto, M Hattori, K Ohashi, C Sugimoto, M Onuma, VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, 49, 4, 375, 386, 1996年01月
英語

Analysis of chicken p53 gene in chicken lymphoblastoid tumor cell lines and field tumors
M Takagi, K Ohashi, T Morimura, C Sugimoto, M Onuma, CURRENT RESEARCH ON MAREK'S DISEASE, 251, 256, 1996年
英語

KINETIC-ANALYSIS OF T-CELLS AND ANTIBODY-PRODUCTION IN CHICKENS INFECTED WITH MAREKS-DISEASE VIRUS
H YAMAMOTO, M HATTORI, K OHASHI, C SUGIMOTO, M ONUMA, JOURNAL OF VETERINARY MEDICAL SCIENCE, 57, 5, 945, 946, 1995年10月
英語

Immunomodulation of peripheral T cells in chickens infected with Marek's disease virus: Involvement in immunosuppression
T. Morimura, M. Hattori, K. Ohashi, C. Sugimoto, M. Onuma, Journal of General Virology, 76, 12, 2979, 2985, 1995年
Microbiology Society, 英語

Possible mechanisms of immuno-suppression in chickens induced by Marek’s disease virus.　　　　　　　　　　　　　　　
日仏獣医学雑誌, 6, 89, 99, 1995年

CHARACTERIZATION OF MAREKS-DISEASE VIRUS BAMHI-A-SPECIFIC CDNA CLONES OBTAINED FROM A MAREKS-DISEASE LYMPHOBLASTOID CELL-LINE
K OHASHI, PH OCONNELL, KA SCHAT, VIROLOGY, 199, 2, 275, 283, 1994年03月
英語

CHARACTERIZATION OF A MAREKS-DISEASE VIRUS BAMHI-L-SPECIFIC CDNA CLONE OBTAINED FROM A MAREKS-DISEASE LYMPHOBLASTOID CELL-LINE
K OHASHI, WP ZHOU, PH OCONNELL, KA SCHAT, JOURNAL OF VIROLOGY, 68, 2, 1191, 1195, 1994年02月
英語, 記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）

cDNA clones derived from the Marek's disease tumor cell line MDCC-CU41.　　　　　　　　　　　　　　　
Proceedings of 19th World's Poultry Congress, 54, 57, 1992年

ANALYSIS OF MAREKS-DISEASE TUMOR-ASSOCIATED SURFACE-ANTIGEN ON MDCC-MSB1-CLO18 CELLS
M HORIE, K OHASHI, H KODAMA, T MIKAMI, INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, 47, 2, 238, 243, 1991年01月
英語

Cytotoxic activity of spleen cells from chickens with transplantable Marek's disease tumors.　　　　　　　　　　　　　　　
Proceedings of 3rd International Symposium on Marek's Disease, 268, 275, 1989年

Suppression of NK activity of spleen cells by chicken fetal antigen present on Marek's disease lymphoblastoid cell line cells
Kazuhiko Ohashi, Takeshi Mikami, Hiroshi Kodama, Hisao Izawa, International Journal of Cancer, 40, 3, 378, 382, 1987年
英語

MONOCLONAL-ANTIBODY TO CHICKEN FETAL ANTIGEN ON MAREKS-DISEASE LYMPHOBLASTOID CELL-LINE MDCC-MSB1
K OHASHI, T MIKAMI, T HIGASHIHARA, H KODAMA, H IZAWA, CANCER RESEARCH, 46, 11, 5858, 5863, 1986年11月
英語

Detection of cell-surface antigens on MDCC-MSB1 cells using monoclonal antibodies.　　　　　　　　　　　　　　　
2nd International Symposium on Marek's Disease, 214, 235, 1985年

MONOCLONAL-ANTIBODIES AGAINST A MAREKS-DISEASE TUMOR-ASSOCIATED SURFACE-ANTIGEN
T HIGASHIHARA, T MIKAMI, K OHASHI, H KODAMA, M ONUMA, H IZAWA, JAPANESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE, 46, 5, 649, 658, 1984年
英語

七面鳥ヘルペスウイルスを応用した抗ワクモ“カクテル”ワクチンの開発
科学研究費助成事業
2023年04月01日 - 2027年03月31日
村田 史郎, 今内 覚, 大橋 和彦
鳥類の外部寄生虫であるワクモによる吸血被害は、世界中の養鶏場で深刻な問題を引き起こしており、最近では薬剤に耐性を示すワクモの出現がその防除をさらに困難にさせている。そのため薬剤に変わる新たな防除法の開発研究が行われているが、その中でもワクチンによる防除法開発が注目されている。本ワクチンは、ワクモの生理機能に重要な分子を抗原として免疫し、血液に含まれる抗体を吸血したワクモに致死的影響を与えることを作用機序とする。しかし、単一の抗原による効果には限界があり、効果増強のためには複数抗原を用いたカクテルワクチンの開発が求められる。また実用化に際しては、従来のワクチンプログラムに抗ワクモワクチンを追加することになり、飼養者の負担が増えることになる。そこで本研究では、家禽の監視伝染病であるマレック病の予防に使用される七面鳥ヘルペスウイルス（HVT）をベクターとして用い、ウイルスゲノムに複数の抗原遺伝子を挿入することで、組換えHVT抗ワクモカクテルワクチンを開発することを目的とした。本年度は、ウイルスベクターとして用いるHVTの感染性クローンの作製に必要なベクター作製と、カクテルワクチンの作製に用いるワクチン抗原の評価を行なった。感染性クローン作製にはpBeloBac11ベクターを用い、ウイルスゲノム中のUS2遺伝子と相同組換えにより置換させることで行う。そのため、HVTのUS2遺伝子の両端の領域をpBeloBac11にクローニングした。さらに薬剤による組換えHVTの選抜のため、ecogpt遺伝子の発現カセットをクローニングした。カクテルワクチンの作製に用いるワクチン抗原として、複数の抗原候補の効果をin vitroにて評価した。その際には、ワクモと形態が類似するその他の家禽の吸血性ダニへの効果も期待される、ユニバーサルワクチンとしての応用の可能性を持つ抗原を選抜した。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23K27063

七面鳥ヘルペスウイルスを応用した抗ワクモ“カクテル”ワクチンの開発
科学研究費助成事業
2023年04月01日 - 2027年03月31日
村田 史郎, 今内 覚, 大橋 和彦
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23H02370

マレック病ウイルス発癌因子Meqの多型と病原性への影響及びワクチン開発への応用
科学研究費助成事業
2023年04月01日 - 2026年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
マレック病ウイルス(MDV)の病原性進化の分子機構を明らかにして新規防除法を確立するために、MDVの病原性に最も重要なMeqについて、挿入や欠損を含むMeqアイソフォームを導入した組換えMDVを作出して、MDVの病原性発現機構を明らかにすることを目的として実施した。
これまでMeqにおける挿入配列が病原性を増強することを明らかにしたが、その詳細について転写活性化能やmeq遺伝子をL-meq遺伝子に置換した組換えMDV（rMDV_L-Meq）を用いた感染実験等で検討した。L-MeqはMeqに比べ高い転写活性化能を示し、rMDV_Meq感染鶏群と比較して、rMDV_L-Meq感染鶏群ではがん関連因子の発現や末梢血におけるCD4+T細胞や制御性T細胞の増加が早期に認められた。一方で腫瘍病変部での発現遺伝子には両群に有意な差は認められなかった。以上よりMeqの挿入配列は、転写活性化能を増強させ早期に病態を形成させることが示唆された。
当研究室では、野外株で欠損配列を持つmeq遺伝子（S-meq遺伝子）の同定・性状解析を報告したが、2022年に過去に報告例のない欠損配列を持つmeq遺伝子が同定されたため、その性状について解析を行なった。検出されたS-meq遺伝子よりも小さく（VS-meq遺伝子）、meq遺伝子と比べて転写活性化調節領域内に192bpの欠損が認められた。またMDV強毒株であるRB-1B株のMeqの配列と比べて、欠損以外に2箇所のアミノ酸配列の相違が認められた。RB-1B MeqとVS-Meqの転写活性化能に差は認められなかったが、欠損以外のアミノ酸配列をそろえたところ、VS-Meqの転写活性化能はRB-1B Meqより有意に高く、VS-Meqの欠損配列が転写活性化能を増加させることが示された。今後、組換えMDVを用いた感染実験により病原性への影響を調査する必要がある。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23K27068

マレック病ウイルス発癌因子Meqの多型と病原性への影響及びワクチン開発への応用
科学研究費助成事業
2023年04月01日 - 2026年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23H02375

動物難治性疾病のアンメット・メディカルニーズに応える発展的治療技術の開発
科学研究費助成事業
2022年04月01日 - 2025年03月31日
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦
アンメット・メディカルニーズとは、未だ有効な治療方法や薬剤がない医療へのニーズを示す。獣医療においてもアンメット・メディカルニーズは難治性疾病を中心に存在する。そこでこれまで開発を進めてきた動物用免疫チェックポイント阻害薬を基盤とした副作用が小さく、より高い奏効率を発揮する発展的な新規治療・予防技術の構築を行い将来的な社会実装・実用化に向けた臨床知見を収集する。牛の慢性感染症では、免疫チェックポイント分子PD-1/PD-L1がT細胞の疲弊を引き起こし、病気の進行に関与している。我々は、ウシのPD-1/PD-L1の結合を特異的に阻害するモノクローナル抗体（mAbs）を確立したが、従来の抗PD-1mAbsは抗原との結合親和性が低いため、治療薬としては適さない。そこで今年度は、高い結合親和性を示す抗ウシPD-1ウサギmAbおよびキメラ抗体を樹立した。抗ウシPD-1ウサギmAbは、従来の抗PD-1 mAbと比較してウシのPD-1に強く結合し、PD-1/PD-L1相互作用に対して顕著な阻害活性を示した。また、キメラ抗体はIFN-γ産生の増強などの免疫活性化を示すことも確認された。さらに、牛伝染性リンパ腫ウイルス感染牛にキメラ抗体を投与し、抗ウイルス効果を調べた結果、抗ウイルス効果が確認された。一方、抗PD-L1抗体による治療を行った肺転移のある口腔内悪性黒色腫のイヌについて、低分割放射線療法と抗PD-L1抗体療法の組み合わせが奏効に及ぼす影響を検討した。その結果、抗PD-L1抗体治療を開始する直前(8 週間以内)に放射線治療を受けていたイヌで肺転移病変に対する奏効率が高く、また免疫療法における生存期間も長くなる傾向が認められた。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23K23768

動物難治性疾病のアンメット・メディカルニーズに応える発展的治療技術の開発
科学研究費助成事業
2022年04月01日 - 2025年03月31日
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 22H02503

鶏の外部寄生虫を種横断的に防除する”ユニバーサル”ワクチン候補分子の探索
科学研究費助成事業
2020年04月01日 - 2023年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
ワクモやトリサシダニは、鳥類の代表的な外部寄生虫であり、鶏に貧血や削痩、産卵率低下など養鶏産業に大きな経済的被害をもたらしている。現在、その防除 には主に駆虫剤が使用されているが、薬剤耐性個体の出現や駆虫剤残存による衛生環境の悪化などが問題となっており、抗ダニワクチンなど新規防除法の開発が必要となっている。そこで本研究では、ワクモとトリサシダニ及び近縁なミナミトリサシダニを同時に防除できるダニ種横断的な新規“ユニバーサル”ワクチン の開発を目指して、RNA-SEQ解析や全ゲノム解析と相同性検索により、これらのダニ間で共通の非暴露型抗原の探索・同定を行い、 吸血したダニ個体に致死的に作用して鶏舎内の寄生虫個体数を持続的に減少できるワクチンへの応用を検討することを目的とした。 今年度は、昨年度実施したRNA-SEQによる発現する遺伝子群の網羅的解析の結果を元にFER2など数種類の候補遺伝子を選抜して、その組換え抗原の調製や機能解析を行った。in vitro feeding assayによる今後交差防御試験を行いワクチン候補抗原としての有用性を確認する。またいくつかのワクモ由来分子の抗ワクモワクチンとしての有用性を検討し、抗ワクモ効果（持続的な個体数の減少）を示す新規抗原を同定した。さらに複数種の抗原を用いたカクテル抗原が単独抗原よりも有効な抗ワクモ効果を示すことも明らかとなった。今後、これらの抗原についても“ユニバーサル”ワクチンへの応用を検討していく。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 20H03137

伴侶動物における腫瘍横断的治療法の新規実用化のための実証研究
科学研究費助成事業
2019年04月01日 - 2022年03月31日
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦
これまでの我々の研究により、イヌの一部のがんではPD-L1が過剰に発現し、抗PD-L1モノクローナル抗体を用いた治療が可能であることが示された。そこでさらに、イヌの様々ながん種におけるPD-L1発現を確認するとともに肺転移のあるイヌ悪性黒色腫に対する抗PD-L1抗体を用いた治療の安全性と有効性を検討した。悪性黒色腫を含むほとんどのイヌの悪性腫瘍でPD-L1の発現が確認された。また、抗PD-L1抗体を用いた治療群では対照群と比較して生存期間が有意に延長した。このことから、PD-L1はイヌのがん免疫療法の有望な標的であることが示された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 19H03114

ワクチン抗原を分泌する組換えマレック病ウイルスを用いたワクモ防除法の開発
科学研究費助成事業
2018年04月01日 - 2021年03月31日
村田 史郎, 今内 覚, 大橋 和彦
多くの国々の養鶏場においてワクモによる吸血被害は深刻な問題で、新たな防除法の開発が必要とされている。新規防除法としてワクチンの応用を検討しており、複数の抗原候補の有用性を示してきたほか、ウイルスベクターの応用についても検討を行っている。本研究では、以前に作製した組換えウイルスの効果増大を目指し、抗原分泌型の組換えウイルスの作製を試みた。抗原分泌を促すためにウイルス由来分泌タンパク質のシグナルペプチドを挿入した組換えウイルスを作製し、抗原の分泌を検討した。しかし、感染細胞内に発現は認められたが、分泌は確認されなかった。ウイルスベクターを用いたワクチン作製には、さらなる工夫と検討が必要である。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 18H02332

国内におけるマレック病ウイルスの従来と異なる病原性進化機構の解明と制御法への応用
科学研究費助成事業
2017年04月01日 - 2020年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
鶏に悪性リンパ腫を主徴とするマレック病（MD）を引き起こすマレック病ウイルス（MDV）における病原性進化の分子機構を解明するために、国内の養鶏場において、ワクチン接種したにも関わらずMDが発生する“ワクチンブレーク”鶏からMDワクチンを除去してMDVを単離して、その病原性などの性状を解析した。その結果、国内で分離されたMDV株は、米国由来の強毒株より鶏に対する病原性は低いがMDを引き起こすことが示された。さらに米国等で報告されている病原性に重要なウイルス遺伝子の多型以外のウイルス由来因子がMDVの病原性進化に関与している可能性が示唆された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 17H03911

世界各地に分布するワクモの遺伝子多型解析および抗ワクモワクチン候補分子の探索
科学研究費助成事業
2016年04月01日 - 2019年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
世界各地で養鶏業に大きな被害をもたらす鶏の外部寄生虫であるワクモ（Dermanyssus gallinae）の新規防除法として抗ワクモワクチンを開発するために、世界各地でワクモ材料を採取し、ワクチン候補分子として同定したワクモ遺伝子群について多型解析を実施した。そして、同定した分子群について、ワクモのin vitro吸血システムや吸血攻撃試験でその有効性を検証した結果、同定した分子群を用いた抗ワクモワクチンはワクモに対する防御効果を示した。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 16H05804

新規抗ワクモワクチン開発のためのワクモ中腸特異的抗原の網羅的解析
科学研究費助成事業
2016年04月01日 - 2018年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
養鶏業に多大な被害をもたらしているワクモに対する新規ワクチンの開発を目指して、その候補抗原としてワクモ中腸に発現する分子の探索を行い、3種の分子を同定し、これら分子がワクモの中腸や卵巣で発現していることを確認した。また既に我々が同定した候補抗原であるカテプシンD様タンパク質について解析した結果、この分子が発育ステージ等に関わらず恒常的に発現し、吸血鶏由来の血清に反応しないことから非暴露型抗原であることが示された。今回同定した分子のより詳細な性状解析を行い、ワクチン抗原として有用性を評価していく必要がある。
日本学術振興会, 挑戦的萌芽研究, 北海道大学, 16K15043

牛白血病清浄化ガイドライン構築のための実証研究
科学研究費助成事業
2014年04月01日 - 2018年03月31日
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦
牛白血病ウイルス(BLV)は、日本を含む多くの国で高い陽性率が報告されている。本研究では、牛白血病清浄化ガイドラインの構築を目的としてBLV感染牛における種々の伝播リスクについて解析を行った。その結果、リンパ球増多症を呈するウシ、ウイルス量が多いウシおよび発症牛が水平感染源になっていることを確認した。さらに感染ウイルス量が多い妊娠牛から帝王切開術により子牛を摘出し、子牛のへの直接的な垂直感染を証明した。本成果は、ウイルス量が高い母牛からの産子の感染検査は、清浄化対策において極めて重要となり、陽性牛から陽性牛が生まれると農場での清浄化は極めて難しく、子牛への感染防御は重要であることを示した。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 26252051

野生水禽や家禽におけるマレック病ウイルスの病原性進化の分子機序の解明
科学研究費助成事業
2014年04月01日 - 2017年03月31日
大橋 和彦, 村田 史郎, 今内 覚
鶏に悪性リンパ腫を主徴とするマレック病（MD）を引き起こすマレック病ウイルス（MDV）の野外における病原性進化の分子機構を解明するために、国内でワクチン接種したにも関わらずMDが発生するワクチンブレーク鶏からMDVを単離して、その分子生物学的性状及びウイルス学的性状を解析した。その結果、分離したMDVは、病原性に重要なウイルス遺伝子に新規の多型が同定され、鶏に病原性を示したが、全ゲノムの系統樹解析の結果、米国等で従来報告されていたものとは異なる分子機構で病原性進化している可能性が示唆された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 26292147

家畜海外悪性伝染病の病態解明と新規制御技術創出への応用展開
科学研究費助成事業
2013年04月01日 - 2017年03月31日
今内 覚, 村田 史郎, 大橋 和彦, 川治 聡子
家畜の悪性伝染病では免疫抑制が認められるが、その機序については明らかになっていなかった。本研究では、海外で甚大な経済的被害を与えているアナプラズマ症、東海岸熱、スーラ病、牛結核、ヨーネ病、牛白血病、ウマ伝染性貧血などの悪性伝染病の免疫抑制機序について解析を行った。その結果、Programmed death 1 (PD-1)やProgrammed death-ligand 1 (PD-L1)などの免疫抑制因子(免疫チェックポイント因子)が病態に深く関与することが明らかとなった。また、抗体などで免疫抑制因子を阻害すると、抗病原体免疫が回復することを明らかにした。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 25257415

ウイルス感染伝播リスク解析を基盤とする牛白血病清浄化モデルの構築
科学研究費助成事業
2011年11月18日 - 2015年03月31日
今内 覚, 大橋 和彦, 村田 史郎, 田島 誉士
増加する牛白血病ウイルス(BLV)による地方病牛白血病は、現在、日本の畜産生産上深刻な問題となっている。本研究ではBLVに新規感染した牛の感染源と媒介昆虫対策による感染阻止効果について検討した。新規感染した牛のBLV遺伝子(env遺伝子)を解析した結果、BLV陽性牛群内でリンパ球増多症を呈するウイルス量が多い牛の遺伝子と一致し、BLVの感染伝播においてハイリスク要因であることが示唆された。一方、吸血昆虫対策を実施した結果、新規感染は認められなかった。このことから、高ウイルス保有牛は感染源になりやすいこと、および昆虫対策は感染伝播阻止に有効であることが示された。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 23248051

神経疾患を引き起こすレトロウイルスの海外拡散の実態とゲノム多様性
科学研究費助成事業
2012年04月01日 - 2014年03月31日
落合 謙爾, 大橋 和彦
研究代表者は「トリのグリオーマ」がA型トリ白血病ウイルス(ALV-A)感染症であることを明らかにした。本課題の目的は神経系に病原性を示すALVの国内外の感染状況ならびに分離株のゲノム多様性と病原性の相関を明らかにすることである。初年度である今年度は国内各地で生産された日本鶏の疫学調査を実施するとともに,海外調査に適した材料採取方法を検討した。得られた成果は以下の通りである。1.国内16ヶ所で生産された日本鶏77羽中26内種を含む68羽(88.3%)がFGV特異的nestedPCRで陽性を示した。2.PCRで陽性となった48羽からALVの分離を試みたところ,8ヶ所,県別に見ると福井,静岡,島根,愛媛および高知の5県で生産された鶏からALV株が分離された。これらのうち,7株のnestedPCR検出領域はFGV特異配列と高い相同性(90～98%)を示した。3.一方,日本鶏にはFGV特異配列を持つ未知の内在性レトロウイルスが存在することが示唆された。このため,FGV特異的PCRの成績の判定だけでは正確な神経病原性ALVの感染率は得られないことがわかった。4.分離株のenvSU領域に基づく分子系統樹では福井,静岡,島根および愛媛で分離された5株がFGVまたはFGV変異株Sp53と同じクラスターに分類された。5.有精卵からのALV分離を試みたところ,ALVは分離されたが,分離率は孵化率に依存するため,海外調査ではこの採取方法を補助的に用いることにした。6.以上の成績から,海外調査を行うためにはFGV特異配列の有無にかかわらず日本鶏に感染するALVを分離し,これらのウイルスゲノムおよび病原性を解析する必要があることがわかった。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 24405042

マレック病ウイルスによる免疫抑制機構の解明とその免疫増強アジュバントへの応用
科学研究費助成事業
2011年04月01日 - 2014年03月31日
大橋 和彦, 今内 覚, 村田 史郎, 村田 史郎
Programmed death 1 (PD-1)レセプターとProgrammed death ligands (PD-L1およびPD-L2)は、難治性感染症や腫瘍において、病原体や腫瘍細胞の免疫抑制機構に役割を果たすことが知られている。本研究により、鶏においても、他の動物と同様に、PD-1およびPD-L1およびPD-L2が免疫抑制能を有することが示された。そしてマレック病ウイルス感染鶏では、PD-1およびPD-L1およびPD-L2が発現しており、特に腫瘍病変部でPD-1およびPD-L2が腫瘍の免疫回避に関与して、マレック病の病態進行に重要な役割を果たすことが示唆された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23380176

レトロウイルスが引き起こす多様な神経障害の分子基盤
科学研究費助成事業
2010年04月01日 - 2014年03月31日
落合 謙爾, 大橋 和彦
研究代表者は「トリのグリオーマ so-called fowl glioma」が A型トリ白血病ウイルス (ALV-A) 感染症であることを明らかにした。本課題の目的は代表者が分離した神経病原性 ALV の解析を通してレトロウイルス誘発性神経障害の分子基盤を解明することである。今年度得られた成績は以下の通りである。1.作製した FGV の感染性分子クローンおよび FGV の gag-pol をトリ白血病ウイルスベクター RCAS(A) のそれと入れ換えたキメラウイルスの神経系に対する病原性を感染実験により解析した。その結果，分子クローンおよびキメラウイルスは鶏に対しグリア結節および囲管性リンパ球浸潤といった非化膿性脳炎を引き起こすが，観察期間内にはグリオーマが誘発されないことがわかった。これは脳内で複製するウイルス量が低いためと推察された。2. 新たに FGV の env/3’LTR および ΔLTR をトリ白血病ウイルスベクター RCAS(A) のそれらと入れ換えたキメラウイルスを作製した。3.FGV 特異配列を欠き，内在性レトロウイルス ev-1 由来と考えられる ALV, Km_5666 株の中枢神経系に対する病原性を感染実験により解析した。感染実験鶏の脳には囲管性リンパ球浸潤，脳室周囲の未分化円形細胞の増殖，グリオーシス，およびグリオーマが誘発された。これら病変の程度は既報の Sp 株に比べて弱く，脳内ウイルス RNA 発現量は検索したいずれの日齢でも Sp-40 株のそれらと比較して低かった。4. 以上の成績から，FGV 特異配列はグリオーマ誘発能とは関連しないことが示唆された。また，グリオーマの形成には ALV 感染初期の脳内ウイルス量が関与することが推察された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 22380162

疾患抵抗性を示す在来種家畜におけるサイトカインストーム回避機序の解明
科学研究費助成事業
2010年 - 2012年
今内 覚, 大橋 和彦
アフリカ大陸、アジア諸国、南米などに古来より生息する在来種家畜や野生動物は、種々の疾病に対して抵抗性を示す。本研究により、外来種家畜が致死的であるスーラ病の起因原虫Trypanosomaevansiや東海岸熱の起因原虫Theileriaparvaに感染しても制御性樹状細胞などの作用により炎症が緩和される結果、サイトカインストームを起こさず疾病に対して抵抗性を示すことが明らかとなった。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 22405036

野生水禽や遺伝的抵抗鶏は何故マレック病を発症しないか:抵抗性因子と分子機序の解明
科学研究費助成事業
2009年 - 2011年
大橋 和彦, 今内 覚
マレック病(MD)に対する抵抗性の分子機構を明らかにするために、マガンなど野生水禽や遺伝的抵抗性鶏における免疫関連因子であり、感染防御に重要であると考えられているインターフェロンγ(IFNγ)の発現調節機構を、ルシフェラーゼアッセイを用いて解析・比較した。その結果、マガンでは、MDウイルス蛋白であるMeqによるIFNγ発現抑制が鶏よりも強く起こり、このことが、MDに対する抵抗性に関与していることが示唆された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 21405034

神経疾患を引き起こすレトロウイルスの原とゲノム多様性
科学研究費助成事業
2008年 - 2011年
落合 謙爾, 大橋 和彦
トリ白血病ウイルスに属すトリのグリオーマ誘発ウイルス(FGV)の出現経緯を明らかにするため,国内外の在来鶏を対象に疫学調査および分離ウイルスの分子系統解析を行った。本研究によって,FGVは過去に海外で発生した本疾患の原因とは関連せず,国内で出現した可能性が高いこと,ならびにFGVとこの変異体はこれらと内在性・外来性レトロウイルス間との組換えを基盤としてゲノム多様性を示しながら今もなお日本鶏の中で拡散していることが明らかとなった。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 20405039

がん・病原微生物によるT細胞機能抑制の分子メカニズム解明とその制御
科学研究費助成事業
2008年 - 2010年
服部 雅一, 大橋 和彦, 杉本 千尋
白血病の発症に伴いマウスの末梢において抗原不応答性に陥ったPD-1^+メモリー型ヘルパーT細胞(PD-1^+MP T細胞) が蓄積することから,他の癌においても同様の現象が見られるかどうかについて,マウス大腸癌細胞株Colon26を用いた移植癌モデルとメチルコラントレン (MCA) を用いた化学発がんモデルを用いて検討を行った。その結果,いずれのモデルにおいても癌組織中へのPD-1^+MP T細胞の蓄積が観察され,癌に普遍的な現象であることが強く示唆された。蓄積したPD-1^+MP T細胞は白血病で見られた細胞同様,抗原刺激に対し無反応であったが,前者とは異なりIL-2添加によりその反応性の回復が見られた。DNAマイクロアレイ解析を行ったところ,オステオポンチン (OPN) の発現上昇やゲノムオーガナイザーであるSATB1の発現低下が観察されたが,白血病のケースで観察されたC/EBPα転写因子の発現上昇は観察されなかった。このことはPD-1^+MP T細胞の抗原府応答性の原因としてSATB1の発現低下あるいはOPNの産生が関与していることを示唆している。PD-1^+MP T細胞は抗原レセプターを介したシグナルに対し増殖を示さなかったが,NK細胞の増殖刺激因子として知られるIL-15に対し反応し,増殖することが明らかとなった。免疫系におけるSATB1の機能を直接検討するために,末梢ヘルパーT細胞において強制的に発現するトランスジェニックマウス (E4POK-SATB1Tgマウス) の作製を試みたが,得られたF1マウスには遺伝子が発現しておらず,現在,再び受精卵へのインジェクションを開始した。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北里大学, 20380160

マレック病ウイルスの病原性進化とワクチンブレークの分子基盤の解明
科学研究費助成事業
2008年 - 2010年
大橋 和彦, 落合 謙爾, 今内 覚
マレック病ウイルス(MDV)の野外における病原性進化の分子機構を明らかにするために、種々のMDV株におけるウイルス遺伝子を解析した。その結果、一部のウイルス遺伝子(meq)に病原性進化に関与すると思われる遺伝子多型が同定された。そこでこれらの遺伝子多型のmeq 遺伝子産物(Meq)の機能に対する影響を解析したところ、Meq の転写活性化能や形質転換能が、多型によるアミノ酸置換により大きく変化することが示され、これらの遺伝子多型のMDV の病原性進化への寄与が示唆された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 20380157

グリオーマ誘発レトロウイルスの神経病原性発現機構の解明
科学研究費助成事業
2006年 - 2009年
落合 謙爾, 大橋 和彦, 小野 悦郎, 富岡 幸子
レトロウイルスの神経病原性発現機構を解明するためにトリ白血病ウイルス(ALVs)に属すトリのグリオーマ誘発ウイルス(FGV),FGV 変異株および神経系腫瘍罹患鶏から得た別のALVsの分子生物学的解析と神経病原性の比較を行った。本研究によってFGVのenvは神経病原性の主な規定因子ではないことが推察された。また,LTRの機能解析に役立つFGV-LTR 導入トランスジェニック鶏 (G0世代)を作出した。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 18380179

トリパノソーマ原虫の薬剤耐性と原虫遺伝子多型の解析
科学研究費助成事業
2006年 - 2008年
小沼 操, 大橋 和彦, 井上 昇, 今内 覚
トリパノソーマ原虫は人、家畜および野生動物に感染し睡眠病、ナガナ病、スーラ病などを引き起こし、多大な被害を与えている。本症は、ワクチンによる制御が困難なうえ、近年、原虫薬剤耐性株の出現によって、その被害は深刻化している。そこで原虫遺伝子多型および薬剤耐性機序解明を目的として、ザンビア共和国およびフィリピン共和国における本症の分子疫学調査を行った。さらに、媒介昆虫であるツェツェバエの吸血宿主の同定、すなわち本症のレゼルボア動物の推定のために、トリパノソーマ感染ツェツェバエ由来のDNAサンプルに含まれる哺乳類動物のミトコンドリア遺伝子を検出し、その遺伝子配列解析から吸血宿主を同定した。その結果、ヒトおよびアフリカゾウ、アフリカバッファローなどの野生動物に加え、調査地区集落の主要な家畜であるヤギの遺伝子も検出されたことから、ヤギにおける本症の分子疫学調査も行い、同地区の高率な感染率を報告した。一方、フィリピン共和国において集団流産が認められた家畜の原因病原体の調査も実施するとともに、抗原虫薬剤治療歴を持つ家畜からトリパノソーマ原虫を分離し薬剤感受性ならびに病原性解析を行った。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 18405037

鳥類由来感染症の疫学的研究　　　　　　　　　　　　　　　
2008年
競争的資金

Epidemiological study on infectious diseases of wild and domestic birds　　　　　　　　　　　　　　　
2008年
競争的資金

抗糖脂質モノクローナル抗体のイヌ型抗体化とメラノーマ治療への応用
科学研究費助成事業
2006年 - 2007年
大橋 和彦, 今内 覚, 奥村 正裕
糖脂質を標的分子とした新規の抗腫瘍療法を開発することを目的として研究として研究を行った。今年度は、平成18年度に調製し、腫瘍細胞、特にイヌ由来メラノーマ細胞株との反応性を確認した各種糖脂質に対するマウスモノクローナル抗体(MAb)パネルのうち、細胞株に広範に反応した抗GM3 MAb(クローンNo.2-14)について、さらに解析を行った。その結果、このクローンMAbは、非常に多くのメラノーマ細胞株に対して試験管内で細胞傷害性を有していることを見出した。また種々のメラノーマ可移植性細胞株を皮下に移植したヌードマウスを用いた治療試験でも、MAbの連続投与により、移植腫瘍の生育が抑制されることが示された(ただし、対照群と治療群の間に統計学的有意差は検出されなかった)。以上より、in vivoにおいても抗GM3 MAbが抗腫瘍効果を発揮できることがマウスモデルで証明された。
昨年度に、抗GM3 MAb(クローンNo.2-14)の抗原結合部位である超可変領域(抗原特異性決定部位)の塩基配列を決定し、イヌ型抗体化を目指して遺伝子発現ベクターへ挿入するため、遺伝子カセットをH鎖・L鎖それぞれにおいて作成したが、今年度は、さらに組み換えイヌ型抗糖脂質MAbの臨床応用を目的として、作成した遺伝子カセットをH鎖・L鎖のバキュロウイルス発現系を用いた組み換えイヌ型抗GM3 MAbの大量発現系の樹立を試みた。しかしながら、その発現量は、あまり高くないことが判明した。発現したL鎖とH鎖について、そのGM3との結合活性を確認したが、単独では結合せず、組み換えL鎖およびH鎖の会合した分子を調製する必要性が示唆された。今後、spacerなどでL鎖およびH鎖を結合した遺伝子を調製し共発現させる系を検討する。
日本学術振興会, 萌芽研究, 北海道大学, 18658123

ダニの唾液由来免疫抑制因子を用いるダニ媒介性病原体の伝播阻止
科学研究費助成事業
2006年 - 2007年
小沼 操, 大橋 和彦, 今内 覚
ダニの発現遺伝子の網羅的解析のため吸血5日目のフタトゲチマダニ(Haemaphysalis longicornis)唾液腺を用いてEST解析(発現タグ解析)を行った。得られた653配列を米国NCBIのblastXプログラムを用いて蛋白データベースと比較したところ、232配列(36%)で有意な相関を示す類似遺伝子が見つかった。その大半は細胞の生存に必要な、いわゆるハウスキーピング遺伝子であったが、1/3は宿主の生理活性に何らかの影響を与え得る因子であると推察された。今回得られた遺伝子の一つは抗凝固因子であるmadanin1と塩基配列で88%、アミノ酸配列で66%の相同性を示した。そこで本因子の生物活性を解析したところ抗凝固活性が認められた。一方、免疫抑制作用が示唆される1配列について宿主免疫への影響を解析した。その結果、牛末梢血単核球(PBMC)やマウス脾臓細胞の増殖反応を濃度依存的に抑制し、サイトカイン(IL-2、IL-12p40およびTNF-α)の発現も強く抑制した。また、BALB/cマウスへの接種では、脾臓の萎縮が認められ、これらのマウス由来の脾臓細胞は各種Mitogenに対する増殖反応が著しく低下し、Microarray解析では免疫活性化因子の発現抑制も認められた。
日本学術振興会, 萌芽研究, 北海道大学, 18658117

レトロウイルス性グリオーマモデルにおける遺伝子サイレンシングの効果
科学研究費助成事業
2005年 - 2007年
落合 謙爾, 大橋 和彦
研究代表者は「トリのグリオーマ」がA型トリ白血病ウイルス感染症であることを明らかにした。本研究課題ではトリのグリオーマ誘発ウイルス(FGV)を感染させた鶏でのRNA干渉(RNAi)の有効性を検討するためにこれまでin vitroでの効果を検討した。まず,分離されたFGVおよびFGV変異株の分子系統解析に基づき,これら分離株のenv遺伝子内に見出された共通な塩基配列を有する領域3カ所を標的とするsiRNAを作製した。今年度は昨年度までの成績を踏まえ鶏胎子線維芽細胞由来株化細胞DF-1を用いたより単純な実験系で,FGV感染または非感染DF-1に対し新たに4種類のsiRNAトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクション効率を上げる条件およびin vitroでの遺伝子抑制効果を検討したが,いずれの条件でも充分な効果は得られなかった。一方,siRNA発現レトロウイルスベクターを用いた実験系を確立するために,遺伝子抑制作用が可視化できる蛍光タンパク質EGFP発現プラスミドを作製し,このプラスミドをDF-1細胞にトランスフェクションして恒常的にEGFPを発現する細胞の確立を検討した。レトロウイルスベクターについてはベクターの遺伝子にsiRNA発現領域を組み込む遺伝子カセットを準備した。本検索により,鶏の細胞でRNAiの有効性を検討することは現状ではきわめて難しいことがわかった。この理由として鶏では培養細胞の種類が少なく電気穿孔法や試薬導入法に使用可能な適切な細胞株が存在しないこと,主に哺乳類細胞用に調整されているトランスフェクション試薬の多くは鶏の細胞では有効ではないことがあげられる。
日本学術振興会, 萌芽研究, 北海道大学, 17658134

オスダニ精巣由来分子を用いた抗ダニワクチンの開発
科学研究費助成事業
2005年 - 2007年
小沼 操, 大橋 和彦, 田島 朋子, 今内 覚
吸血中のコイタマダニ精巣から候補抗原を探索するため発現遺伝子解析法(Expressed Sequence Tag: EST法)を行った。得られた塩基配列はデータベースに登録されている塩基配列と比較し、精巣内での発現遺伝子の網羅的解析を行った。また、キララマダニ(Amblyomma hebraeum)でメスダニに対して吸血促進効果が報告されている精巣由来分子、Engorgement Factorを標的として相同性クローニングを行った。コイタマダニの精巣cDNAライブラリーから得られた遺伝子を解析したところ、シカダニ(Ixodes sulcatus)のオス特異遺伝子(Is5)に類似したcDNAが1クローン得られた。この遺伝子(RAMF)は吸血中のオスダニ精巣に特異的に発現しており、予測アミノ酸配列からシグナル配列と糖鎖付加部位が推測されたため、交尾時のオスダニで精包に分泌されている分子であると考えられた。組み換えRAMFを作成・精製し、未交尾メスダニの血体腔に組み換え体を接種したところ、有意な吸血助長効果は見られなかったが、メスダニの吸血期間が延長する効果が認められた。このことから、交尾中にオスからメスに受け渡されメスの吸血行動に関与することが確認された。
コイタマダニから相同性クローニングによってEngorgement Factorに類似した遺伝子が得られたため、この配列から5'および3'-RACE法によって完全長cDNAを得た。コイタマダニ由来のEngorgement Factor類似遺伝子は分子量16.9kDaのタンパク質をコードするとされ推測され、予測アミノ酸配列がIs5と80%と高い相同性を持っていた。RT-PCRおよびreal-time RT-PCRによる解析から吸血に伴い精巣で優位に発現する遺伝子であることが確認された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 17380177

中枢神経系に病原性を示すトリレトロウイルスの分子系統進化
科学研究費助成事業
2004年 - 2007年
落合 謙爾, 大橋 和彦
トリ白血病ウイルス(ALV)は通常造血器系腫瘍を誘発するが, ALV-Aに属すトリのグリオーマ誘発ウイルス(FGV)は星状膠細胞腫を誘発する。FGVは国内初発例を生産した富山のA動物園から国内に拡がったと推察されるが,FGVがいつどのような経緯で神経系への腫瘍原性を獲得したのか,その詳細はいまだ明らかにされていない。本研究課題では,まずFGVの3'UTR領染域に特異的なnested PCRを確立し,A動物園およびA動物園から鶏を譲渡された3つの動物園の日本鶏計129羽の感染率を調べた。その結果,4ヶ所の陽性率は26〜56%で,分離した14株の分子系統解析によりこれらはFGV変異株であることがわかった。次に血縁関係のない鶏を調べた。日本鶏の伝播経路に沿ってインドネシア,フィリピン,韓国および日本を含む国内外7ヶ所の在来鶏または日本鶏計264羽を検索した。264羽のうち海外の鶏9羽を含む29羽がNested PCR陽性で, PGR増幅産物の塩基配列はFGVと98%相同であった。国内の鶏6羽からはFGVが分離された。一方,国内の採卵鶏にグリオーマと皮下腫瘍併発例が見出され,これらからFGVとは異なるALV(TymS_90株)が分離された。さらに神経周膜腫や神経線維腫が他の日本鶏から見つかり,これらからは内因性レトロウイルスの変異株が検出された。以上の成績から,国内にはFGV変異株が蔓延していること,FGVは国内初発例の鶏と血縁のない国内外の鶏にも感染していること,国内にはFGV以外にも神経系に腫瘍を誘発するALVが存在することが明らかとなった。結論として,FGVは富山で出現したのではなく,他の地域で出現し,その後FGV感染鶏が富山に持ち込まれ繁殖に利用されたと推察される。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 16405033

強毒化するマレック病ウイルスに迅速に対応できる新規ワクチン作製技術の開発
科学研究費助成事業
2004年 - 2006年
大橋 和彦, 小沼 操, 落合 謙爾, 高木 道浩
野外でワクチンブレークを起こす超強毒マレック病ウイルス(vvMDV)の生物学的性状を解明や病原性進化に伴う変化の同定を行い、我々が同定したL-meq遺伝子を応用して野外で発生するワクチンブレークに対応できる新規のワクチンを開発するを目的に行った。
国内のvvMDVの性状を解析するため、野鳥や日本国内で発生したワクチンブレーク鶏より材料を採取して、従来報告されているvvMDVとの比較を行った。野鳥由来や国内分離MDVのmeq遺伝子(MDVの発癌遺伝子)は従来報告されているvvMDVと高い相同性を示したが、報告されていない変異も同定された。またgB遺伝子に北海道株特異的な遺伝子変異を、野鳥由来や国内分離MDVの一部のgL遺伝子には、vvMDVで報告されている変異を同定した。これまでMDVの強毒化に伴うmeqの多型が同定されているので、今回同定した変異がmeqの機能にどのような影響を及ぼすかを解析した。従来報告されているvvMDVのmeqは高い転写活性を示し、転写活性化ドメインにおける多型が重要であることが示唆された。北海道株等で同定したmeq遺伝子の転写活性化ドメインにおける特異的な変異について検討したが、その変異による転写活性能の上昇は顕著ではなかった。弱毒株等で同定したL-meqはmeqの転写活性化を抑制することが示され、vvMDVの潜伏感染維持のためにウイルス複製を抑制する可能性が示された。次にマレック病腫瘍細胞株において特異的に発現するmeq転写変異体(Δmeq)の腫瘍形質維持や細胞死への関与について解析した。Δmeqはアポトーシス誘導時に発現が上昇し、他のmeq遺伝子産物の転写活性を抑制した。以上よりΔmeqは抑制因子としてL-meqやmeqの機能を阻害し、アポトーシスやMDVの再活性化に関与しており、細胞死誘導型新規ワクチンへの応用の可能性が示された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 16380203

サイトカイン遺伝子多型解析による疾患抵抗性家畜の選抜
科学研究費助成事業
2004年 - 2005年
大橋 和彦, 小沼 操
前年度、腫瘍壊死因子(TNF-α)遺伝子プロモーター領域における多型が牛白血病の病態進行に関与する可能性を示唆した。本年度はTNF-α発現と牛白血病の病態進行との関係を詳細に検討した。白血病発症期あるいは持続性リンパ球増多症を発症した牛では、正常牛あるいは感染無症状キャリアー期の牛に比べ、膜結合型TNF-αの発現が高く、持続性リンパ球増多症由来リンパ球(主にCD5陽性細胞)では、発現したTNF-αが自発性増殖に直接関与していることを示した。またこの自発性増殖リンパ球に抗TNF-α抗体を添加するとその増殖が抑制されることも示した。このことはTNF-α遺伝子プロモーター領域における多型と、それに伴うTNF-α発現増強が牛白血病ウイルス(BLV)感染牛のリンパ球の自発性(腫瘍性)増殖能を少なくとも部分的に規定していることを示し、TNF-α遺伝子プロモーター領域における多型を解析することで、病態進行をある程度予想できることを示唆している。
TNF-αの作用は、細胞表面の2種類のTNF-αレセプター(TNF-RIとTNF-RII)で規定され、TNF-RIは細胞死の誘導に、またTNF-RIIは細胞増殖に作用する。そこでさらにTNF-αと牛白血病の病態進行との関連を検討するため、牛白血病の病態進行に伴うTNF-αレセプターの発現を解析した。その結果、持続性リンパ球増多症由来リンパ球では、非感染牛由来のものに比べてTNF-RI mRNAの発現に違いがないが、TNF-RII mRNAの発現が亢進していた。このことは、牛白血病の病態進行には、TNF-αの発現のみならず、TNF-αレセプター発現のバランスも密接に関与していることを示している。今後、TNF-αレセプターの発現を制御する遺伝子領域における多型の存在の有無や多型とレセプター発現との関連を解析する必要がある。
日本学術振興会, 萌芽研究, 北海道大学, 16658112

マガン由来強毒型マレック病ウイルスのゲノム解析とその国内侵入の可能性の検討
科学研究費助成事業
2003年 - 2005年
大橋 和彦, 小沼 操, 高木 道浩, 浅川 満彦
マガン由来マレック病ウイルス血清型1(MDV1)の病原性及び日本国内への強毒ウイルスの導入の可能性を明らかにするため、平成15〜17年度に北海道やロシアのガン・カモ類の飛来地・換羽地などでの材料採取を行った。北海道クッチャロ湖畔でカモ類200羽、ロシアカムチャツカ半島南部でヒシクイ63羽、飼育されているシジュウカラガン15羽、ロシアチェトコ自治区アナディル近郊でマガン50羽を捕獲し、羽(羽軸)及び血液材料(血液濾紙)を採取した。また北海道宮島沼でのマガン捕獲も行い(147羽)、同様に材料を採取した。これらの材料より、全細胞DNAを抽出し、当研究室で樹立したMDV1のmeq遺伝子を標的としたnested PCR法にてMDV1の遺伝子診断を行った。その結果、カモ類からは、MDV1は検出されなかったが、マガンなどガン由来材料の25〜30%からMDV1が検出された。これらのガン類は臨床的症状を示してはいなかったが、本研究で野生ガン類のMDV1汚染が明らかとなった。
さらにマガン由来MDV1の病原性を解析するために、検出されたMDV1のmeq遺伝子やgB遺伝子などについて塩基配列を解析した。ガン類由来MDV1のmeq遺伝子は、これまで報告されている超強毒MDV1のmeq遺伝子と高い相同性を示し、さらにgL遺伝子において超強毒MDV1で報告されている変異が存在していた。このことはガン類では強毒MDV1株が感染・維持されていることを示している。しかしgB遺伝子の比較の結果、北海道でワクチンブレークを起こした鶏から検出された強毒MDV1とは若干異なっていることが示されたが、ロシアで分離したマガン由来MDV1株のひとつが、北海道で分離されたMDV1株と近縁であり、マガン-鶏間のMDV1の伝播の可能性も示唆された。今後、より多くのマガンあるいは他の野鳥由来MDV株の性状解析が必要と思われる。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 15405038

南アジアに分布する牛レンチウイルスの分子系統進化
科学研究費助成事業
2003年 - 2005年
小沼 操, 大橋 和彦
牛レンチウイルスである牛免疫不全ウイルス(BIV)の分離株での遺伝子変異を知るためにまず日本での抗体調査から初めた。北海道ではほぼ10%程度の陽性率を示していた。これら陽性牛の末梢血リンパ球より3株が分離された。この3株の分離株についてまず、pol領域の解析を行なった。その結果、アメリカの分離株(R-29)と比較して塩基配列で99%と高い相同性を示した。次いでenv領域についてアメリカ株(R-29)と比較を行った。env領域のうちこれまで分離株間で比較的保存されている領域C2,C3ならびに変異の大きいV1,V2について比較した。日本分離株ではこれらの領域の一部で増幅がみられR-29と比較した。その結果、C2,C3領域では比較的相同性が高かったもののV1,V2領域では、変異ならびに欠失がみられた。
カンボジアでは、プノンペン周辺の5地区より無作為的に牛(544頭)、ならびに水牛(42頭)の血液材料を得た。BIVは陽性率は牛で26%、水牛で17%であった。BIV抗体陽性牛のリンパ球より5株のBIVを分離し、その性状を調べた。BIVエンベロープ遺伝子の塩基配列を決定した後、アメリカならびに日本の分離株とエンベロープ遺伝子中の保存領域C2,C3ならびに超変異部位V1,V2について比較した。その結果、日本とカンボジアの分離株のenv遺伝子は、アメリカ株のenvにくらべ短く、遺伝子欠損がみられている。
一方、アフリカのザンビアでも牛の材料(262検体)を得ることができたので調査した。これらの血清ではBIV抗体陽性率は、それぞれ11.4%であり、抗体陽性牛の末梢血リンパ球よりBIVの分離を行い4株を得た。これら4株のpol遺伝子のアミノ配列を日本やアメリカ分離株と比較したところ97%以上の高い相補性を示していた。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 15405035

レトロウイルス誘発性グリオーマの発がん機構解明とグリオーマモデルの作出
科学研究費助成事業
2003年 - 2005年
落合 謙爾, 大橋 和彦, 小野 悦郎
「いわゆるトリのグリオーマ(星状膠細胞腫)so-called fowl glioma」はその原因と病態が不明であった疾患である。申請者らは以前本疾患がA型トリ白血病ウイルス(ALV-A)感染症であることを明らかにした。本研究課題の目的はトリのグリオーマ原因ウイルス(FGV)の神経病原性とこれに関わるウイルスゲノムenvとLTRの機能を解明することである。まず,FGVの病原性を解析した。その結果,既知のALVは主に造血器系腫瘍を誘発するのに対し,分離したALVは心臓と脳で活発に複製され,グリオーマのほか,非化膿性脳炎,神経周膜腫,小脳低形成など神経組織に対して病原性,腫瘍原性を持つことを明らかにした。ゲノム解析では本ウイルスは数種のALVゲノムの組み換えにより出現したことが示唆された(EMBL,GenBank,and DDBJヌクレオチドシークエンスデータベースアクセッションNo.AB112960)。既知のALVsと比較してFGV-LTRのU3領域には欠損と変異が見られ,LTRのプロモーター活性もわずかながら差が見られたことから,この領域がFGVの神経病原性と関連していると推察された。次に本疾患の脳病変51例を検索し,本疾患には星状膠細胞がびまん性に増殖する亜型が存在することを示唆した。また,原因と病態を加味し本疾患はトリの「レトロウイルス性星状膠細胞腫」と命名するのが適切であることを示した。さらにin vivoでのFGV-LTRプロモーター活性を調べるため,LTRとGFPを遺伝子導入したトランスジェニックマウス13系統を作製してRT-PCRでGFPのmRNAを検出した。その結果,FGV-LTRプロモーターはin vivoでpan-specificプロモーターとして機能する一方、中枢神経系および精巣で安定した導入遺伝子発現を誘導することを明らかにした。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 15380207

異常型プリオン蛋白質の細胞内増殖の分子機構
科学研究費助成事業
2003年 - 2005年
堀内 基広, 稲葉 睦, 大橋 和彦, 前田 秋彦, 古岡 秀文
本研究では、PrP^産生を阻害する物質の作用機序の解析、および、プリオン増殖に関与する宿主因子や微小環境の同定、からプリオンの細胞内増殖機構を紐解くための研究を行った。
細胞膜上に発現するPrP^Cと反応する4種の抗PrP抗体が、プリオン持続感染細胞におけるPrP^産生を抑制した。細胞膜上のPrP^Cと結合した抗体は細胞膜上に停留する傾向があることから、PrP^Cと抗体が結合して、PrP^Cが通常の分解経路に移行しなくなることが、PrP^産生抑制の原因と考えられた。また、人工硫酸化糖のプリオン増殖抑制能を調べた結果、4-Sulfo-N-acetylglucosamineおよび6-Sulfo-N-acetylglucosamineにPrP^産生抑制活性が認められた。これらを細胞に添加した場合、PrP^Cのエンドサイトーシスが促進され、総PrP^C量が減少した。一方、PrP^産生抑制活性のない硫酸化糖はPrP^Cのエンドサイトーシスを促進しなかった。従って硫酸化糖によるPrP^産生抑制は、PrP^Cの分解促進が原因と考えられた。
マウス神経芽細胞Neuro2aのサブクローンを多数樹立して、プリオン感受性および非感受性に分類した。プリオン非感受性のN2a-1ではPrP^Cの発現は親株やプリオン感受性N2aサブクローンと同程度であった。プリオン感受性サブクローンN2a-3およびN2a-5とN2a-1におけるPrP^の吸着を検討したが、感受性・非感受性サブクローン間でPrP^の吸着には差が認められなかった。N2a-1のようにPrP^Cは発現するがプリオン非感受性の細胞の存在は、PrP^C以外にもプリオン感受性に関与する宿主因子の存在を示す結果である。そこで、樹立したN2aサブクローン間での遺伝子発現をDNAマイクロアレイ法により解析した。プリオン感受性細胞で2倍以上発現が高い遺伝子を36種、プリオン非感受性細胞で2倍以上発現が高い遺伝子を18種、候補遺伝子として選抜した。候補遺伝子に対するsiRNAを用いて標的遺伝子の発現を抑制し、プリオン感受性への影響を調べた。その結果、F2,A1,C5の3遺伝子に対するsiRNAが、N2a-5におけるプリオン増殖を抑制することが明らかとなった。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 15208029

組み換えH鎖抗体を用いた血液脳関門デリバリーによる脳炎の治療
科学研究費助成事業
2003年 - 2004年
小沼 操, 杉本 千尋, 大橋 和彦
抗体と毒素を人工的に結合させたイムノトキシンは癌治療に注目されている。そこで単クローン抗体産生細胞より抗体H鎖およびL鎖超可変領域のCD領域をクローニングし、遺伝子工学的に一本鎖抗体を構築した。一方、トキシンとしては緑膿菌から毒素遺伝子をクローニングし、組み換え緑膿菌毒素(PE38KDEL)を構築して一本鎖抗体と結合させイムノトキシンを作出した。このイムノトキシン遺伝子を大腸菌発現系を用い組み換え蛋白として発現させた。今回用いた単クローン抗体は鶏マレック病ウイルス(MDV)gBに対するものであり、MDVgB遺伝子発現細胞に対する作用を調べた。その結果、組み換えイムノトキシンはMDVgB発現細胞と特異的に結合し、緑膿菌毒素により細胞障害作用を示した。また組み換えイムノトキシンをMDVに処理するとMDVによるプラーク形成が顕著に阻害された。この成績はイムノトキシンが抗ウイルス活性のあることを示している。今後一本鎖抗体に結合させたイムノトキシンの抗腫瘍活性についても検討する予定である。
一方、リャマとラクダの免疫系を知る目的でリャマとラクダのサイトカイン遺伝子の解析を行った。方法は、末梢血リンパ球のmRNAから作成したcDNAより、牛・豚等の既知サイトカイン遺伝子の蛋白質コード領域の塩基配列をもとにプライマーを設計し、PCR法で増幅する方法である。この方法でこれまでにIL-1,2,4,6,8,10,12の他、IFNγ、TNFαなど多くのサイトカイン遺伝子を明らかにした。またReal-time PCRによる定量法を確立しラクダでのブルセラ菌感染に対するサイトカインプロファイルの変化を明らかにした。すなわちブルセラ菌生ワクチン接種ラクダではTh1系サイトカインの顕著な活性化がみられた。
日本学術振興会, 萌芽研究, 北海道大学, 15658095

ダニ由来有用生理活性分子の探索とその利用
科学研究費助成事業
2003年 - 2004年
小沼 操, 大橋 和彦
ダニワクチン抗原の候補を探索する方法としてcDNAライブラリーを用いた発現遺伝子解析法(EST法)がある。今回、ダニ由来有用物質を検索するため、フタトゲチマダニ(H. longicornis)吸血中のダニの唾液腺で発現している遺伝子のEST解析を行った。得られた653遺伝子を解析したところ、blastXによる相同性検索により機能予測がなされたものは全体の35%であり、その大半は細胞の生存に必要なハウスキーピング遺伝子であった。生理活性を有すると予測された蛋白配列中には、既知の抗血液凝固物質(madanin 1)や抗炎症物質、免疫抑制作用物質と類似の配列が含まれており、これらの遺伝子の多くが分泌シグナルを併せ持つことから、宿主体内に注入される物質であることが示唆された。
分泌シグナルを持ち、宿主に注入されて何らかの生理作用を示す物質であることが示唆された蛋白遺伝子の中から、転写コピー数の多かったものを6遺伝子(c-1〜c-6)ピックアップし、ダニの吸血ステージに伴った発現量の変化を調べた。未吸血、吸血直前(宿主刺激あり)、吸血後3日、吸血後6日及び飽血後の5時点で比較したところ、いずれも吸血後3日(c-1では3日及び6日)に最も高い発現量を示し、吸血前や飽血時の発現量はごく僅か(あるいは検出限界以下)であった。また、いずれも中腸においてはその発現が観察されず、宿主に注入されることによって吸血の維持に関与している生理活性蛋白であることが示唆された。
また、他種のダニ(Dermacentor andersoni)で免疫抑制作用が報告されている蛋白質(Da-p36)の類似遺伝子を大腸菌に導入して発現し、その組み換え蛋白(HL27)の機能を調べた。インビトロにおけるリンパ球の増殖抑制試験を行ったところ、HL27濃度0.1ppmでリンパ球のコンカナバリンAに対する増殖反応の有意な抑制が観察された。さらに、HL27濃度10ppmではリンパ球の増殖反応はほぼ完全に阻害され、Da-p36同様の免疫抑制作用を持つことが示された。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 15380206

動物ウイルス感染症防除のための分子擬態利用技術の開発
科学研究費助成事業
2001年 - 2003年
大橋 和彦, 高木 道浩, 杉本 千尋, 小沼 操
ウイルス、細菌などの病原体には標的細胞への吸着の際、細胞表面糖鎖をレセプターとして利用しているものが多く、このようなレセプターをワクチンなどに利用すれば、株間で抗原性が異なる病原体に対しても広く有効な防除法を開発することが可能になる。そこで感染症防除のためにこれらの糖鎖を擬態できるようなペプチドを探索・同定し分子擬態利用法を開発するため、ウイルス(NDV)をモデルとしてNDVレセプター構造を分子構造的に模倣するレセプター擬態ペプチド分子を探索し、そのNDV感染に対する防御能を検討した。
NDVヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ(HN)抗原を標的として特異的に結合するペプチド分子をランダムペプチドライブラリー(6mer〜8merのペプチドを含む)よりファージディスプレイ法とバイオパンニング法により探索した。その結果、NDV HN抗原に対して特異的結合性を示す3種類のファージクローンが得られた。得られたクローンの塩基配列・アミノ酸残基を解析した結果、EVSHPKVG、WVTTSNQW、SGGSNRSPの3種類のアミノ酸配列が擬態分子として同定された。さらに各ファージクローンのNDV特異的結合能は、抗NDVニワトリ抗血清を利用したELISA競合阻止試験によっても確認された。
次にこれらの各ファージクローンより予想されたアミノ酸配列をもとに合成ペプチドを作製し、NDV粒子に対する結合能や感染防御能を解析した。3種類の合成ペプチドはNDVによる赤血球凝集活性を阻止できなかった。しかしながら、ウイルス中和試験の結果、これらのペプチドが部分的にNDVの感染を中和できることが示された。今後、これらのペプチドが結合するNDV粒子状の分子を明らかにするとともに、そのアミノ酸配列をもとに、よりNDV感染阻止能力の高いアミノ酸配列を模索し、in vivoにおける効果を検討することが、臨床応用に向けて必要となる。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 13556045

ダニの吸血を阻害する抗ダニワクチンの開発
科学研究費助成事業
2000年 - 2003年
小沼 操, 杉本 千尋, 大橋 和彦, 畠山 英樹
ダニの吸血を介して伝播する感染症(ダニ媒介性感染症)の制圧方法として宿主にダニ抵抗性を賦与し、ダニの吸血を阻害することにより感染ダニからの病原体の伝播を阻止することを目指した。そのため本研究ではダニ由来の有効成分を同定し、抗ダニ効果を示すか否か検討することから始めた。
これまでにダニの唾液腺由来の抗ダニ効果をもつp29,HL34,HLS1を同定した。加えて抗血液凝固活性を示すセルピンであるHLS2も同定し、その抗ダニ活性を明らかにした。また、より効果的な候補抗原の検索を目的とし、Haemaphisalislongicornis唾液腺由来遺伝子のESTデータベースのを構築した。現在までにダニの吸血維持に関与する可能性のある分子としてmetaro protease、protease inhibitorをコードすると思われる遺伝子を発見している。加えて、異種ダニ間に存在する共通抗原を検索し有効範囲の広い抗ダニワクチンを開発することを目的とし、Boophilus microplus において既にワクチン効果を検討されている蛋白の遺伝子配列を基に設計したプライマーからRACE法を用いて相同遺伝子を検出している。現在までに、H.longicornisからBoophilus yolk cathepsin、tick heme binding aspartic protease、paramiosin、calreticulin、glutatione Stransferaseなどの遺伝子断片が得られている。
現在、これらダニ由来分子の大腸菌組み換え蛋白のカクテルを用いての病原体伝播の阻害効果について検討している。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 12356008

宿主免疫系を修飾するマダニ由来セリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)の解析
科学研究費助成事業
2001年 - 2002年
小沼 操, 山崎 真大, 大橋 和彦
セリンプロテアーゼは血液凝固、補体活性化をはじめ広く神経・免疫系に作用するなど重要な生理機能をもつ。セリンプロテアーゼインヒビターであるセルピンは、セリンプロテアーゼ活性を制御することにより生体の恒常性の維持を担っている。マダニは宿主に吸血すると約2週間という長期にわたり吸血を行なう。この吸血を促進するためマダニは唾液腺より種々の蛋白質を分泌する。この分泌蛋白のうちの1つとしてセルピンが考えられている。このマダニ分泌蛋白質により宿主の免疫系は修飾(免疫抑制、抗炎症作用)され、それがマダニの吸血促進に役立つと同時にダニ媒介性病原体の伝播を助けている。
他の生物間で知られているセルピン遺伝子内の保存されているアミノ酸配列をもとに設計したプライマーを用いて、フタトゲチマダニ(Haemophysalis longicornis)唾液腺抽出RNAを鋳型に3'および5'RACE法を行った。これまでに4つの遺伝子が得られた。これらの遺伝子は他のダニ(Ixodes ricinus)のセルピン遺伝子と高い相同性を示した。このうち1クローン(HLS1)について大腸菌により組み換え蛋白を発現させ、抗ダニワクチンの可能性について検討したところ若ダニ、成ダニで有意なワクチン効果を認めた。HLS1遺伝子は吸血刺激により主にダニの中腸で発現するタンパクであり唾液腺では発現していなかった。現在、病原体伝播の阻止について検討している。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 13460128

動物では初めてのウイルス誘発性中枢神経系腫瘍(神経膠腫)の特徴
科学研究費助成事業
2000年 - 2001年
落合 謙爾, 大橋 和彦
鶏には散在性髄膜脳炎を背景にもちながらアストロサイトが腫瘍様に増殖する、いわゆるトリの神経膠腫が知られている。しかし、本疾患の原因や病変性状は十分に明らかにされていない。本研究ではトリの神経膠腫の原因、病態を明らかにすべく実験病理学的検索を行った。得られた成果は以下の通りである。1.チャボとSPF鶏の脳内に本疾患罹患脳乳剤またはこれを接種した鶏胚細胞(CEF)培養上清を接種すると、本疾患特有の病変が再現された。このことから、本疾患の他個体への伝達性、すなわち病原ウイルスの関与が示唆された。2.罹患脳乳剤を接種したCEFおよび培養上清からALVと推察されるウイルスが分離された。このウイルスは径100nmで感染CEFの細胞膜に形成されていたウイルス粒子の出芽像はC型レトロウイルスが複製時に形成する出芽像に酷似していた。3.CEF内に存在するALVプロウイルスのenv領域をシークエンスして標準ウイルス株と比較すると、分離したウイルスはALV-A亜群と90%以上、B亜群と92%以上の相同性を示すenv領域を持っていた。4.接種実験鶏には非化膿性心筋炎が高率に併発していた。これらの心筋細胞はウイルス抗原に強陽性を示し、ALV感染時に形成される基質封入体も多数認められた。このことから、原因ウイルスは特に心筋線維で複製する傾向があり、本疾患に関連して非化膿性心筋炎が起こることが明らかとなった。5.初期の結節性脳病変には間葉性細胞が混在せず、小結節は異型性をもつ星状膠細胞の増殖からなっていた。6.実験例の一部に概ね全身の末梢神経系を冒す腫瘍が発生した。これは神経周膜細胞に由来する腫瘍であることが病理学的検索から明らかとなった。
以上の成績から、トリの神経膠腫はALV-AまたはB亜群によって引き起こされるウイルス感染症であることが明らかとなった。本ウイルスに鶏が罹患すると非化膿性脳炎・心筋炎が発生し、その後、約4ケ月から1〜2年を経て、星状膠細胞あるいは星状膠細胞と間葉性細胞が混在する腫瘍、もしくは、神経周膜細胞腫が発生することが示唆された。本研究の成績から、本疾患の名称はトリのウイルス性神経膠腫と改変されるのが妥当と考えられた。
日本学術振興会, 基盤研究(C), 北海道大学, 12660280

中南米に分布するタイレリア原虫の分子系統進化
科学研究費助成事業
2000年 - 2001年
小沼 操, 辻 正義, 岩永 敏彦, 杉本 千尋, 角田 勤, 大橋 和彦
タイレリア原虫は全世界に分布している。日本のタイレリア原虫(Theileria sergenti)と類似の原虫は環太平洋,アジア,ヨーロッパに分布しているが、これらの原虫種の分類学的関連は不明である。本原虫は宿主体内で巧みに免疫を回避することや、感染がダニを介することなどによりいまだ制圧されていない。わが国においても本原虫による小型ピロプラズマ感染症は経済的被害が大きく本病の防除が強く望まれている。タイレリア属に分類される原虫は10種類以上知られているがT.parvaやT.annulataならびに日本を始め東に分布するT.sergentiはモノクローナル抗体を用いた抗原性状や原虫遺伝子の解析が進んでいる。しかし南アジア、豪州、ヨーロッパに分布するT.buffeliやT.orientalisの解析は遅れている。加えて北米、中南米に分布するタイレリア原虫(Theileria sp.)についてはほとんど解析されていない。
本研究は中南米の国々でタイレリア原虫ならびに媒介ダニを採集し、日本の原虫、媒介ダニと比較することにある。昨年度ブラジルから得た200検体あまりのウシの血液を解析したが全くタイレリア原虫は得られなかったことより、南米ではほとんどタイレリア原虫(とくに病原性タイレリア原虫)が分布していないものと考えられる。そこで今年度はダニに注目して解析した。それは世界に分布するタイレリア原虫の媒介ダニの唾液成分の遺伝子を比較することにより共進化していきたタイレリア原虫の相違を知ることができるのではないかと考えられるからである。そこでまず、ブラジルのBoophilus microplusやAmblyoma americanumでとられている唾液腺由来のカルレチクリンに注目した。カルレチクリンはカルシウム結合蛋白で、ダニの吸血の際宿主の補体活性化や血液凝固を阻害し吸血持続していると考えられている。そこでカルレチクリン遺伝子をアフリカのダニ、Rhipicehalus appeendiculatusのダニ唾液腺cDNAライブラリーよりRACE法で得た。その結果、この遺伝子は1224塩基で408個のアミノ酸をコードしていた。他のダニ(Boophilus, Amblyoma)の遺伝子と比較したところ、アミノ酸配列で87%〜94%の相同性を示した。次に血液凝固阻害に重要な役割をもつダニ唾液腺由来のセルピン(セリンプロテアーゼインヒビター)に注目し、アフリカのダニ、R.appendiculatusとHaemphisalis longicornisより同じくRACE法により遺伝子を得た。R.appendiculatusから4つ、H.longicornisから3つの遺伝子を得た。これらは大腸菌で発現させ、生物活性を調べている。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 12575027

組み換えマレック病ウイルスを用いたアポトーシス誘導型抗腫瘍ワクチンの試作
科学研究費助成事業
1999年 - 2000年
大橋 和彦, 高木 道浩, 杉本 千尋
マレック病ウイルス(MDV)は鶏に悪性リンパ腫を起こすが、腫瘍化機構は不明である。MDVは3種の血清型に分類され、MDV血清型1(MDV1)はワクチン株(CVI988等)を除いて自然宿主の鶏に腫瘍を起こす。そこで腫瘍化初期に腫瘍特異的にアポトーシスを誘導して生体から除去できるワクチンの開発を目的として組換えMDVの試作を行った。アポトーシス誘導遺伝子は鶏貧血ウイルスVP3遺伝子を用い、VP3遺伝子を腫瘍細胞特異的に発現できるようにmeqプロモーター制御下で発現するカセットを作成してアポトーシス誘導能を検討した。またその過程で腫瘍化に重要と考えられているmeq遺伝子について、強毒および弱毒MDV1株間での相違を見いだしたので詳細に解析した。
VP3遺伝子とmeqプロモーターを連結した(meq-VP3)遺伝子カセットをMD腫瘍細胞株に導入しそのアポトーシス誘導能をDNAの断片化で検討したところ、経時的に細胞の生存率が減少し、その際DNA断片化が観察された。このことはVP3-meq遺伝子カセットがマレック病腫瘍のアポトーシスによる除去に応用可能であることを示している。そこでこのmeq-VP3遺伝子カセットを挿入した組み換えMDVの作製を行った。
強毒MDV1株(RB1B、Md5、JM)やワクチン株CVI988のmeq遺伝子構造をPCR法やサザンブロット法で解析した。強毒MDV1株ではmeqのみが検出されたが、CVI988では、meqと共により大きいサイズのL-meqが検出された。またJM株を70代以上継代・弱毒化したものでもL-meqが検出された。L-meqはMeqタンパクコート領域に178個の塩基が挿入された新規遺伝子でありフレームシフトが起こっていた。MD腫瘍由来株化細胞のDNAを同様に解析したところ、全てのものでL-meqが検出された。このmeq遺伝子の変化がCVI988株の弱毒化と腫瘍原性の消失に関与していることが示唆され、MD腫瘍株化細胞でもL-meqが存在していたことから、meqが腫瘍化には重要であるが腫瘍形質の維持には必須ではないことも示された。
日本学術振興会, 基盤研究(C), 北海道大学, 11836001

アフリカにおける野生動物寄生病原体の新宿主獲得戦略の分子論的解析
科学研究費助成事業
1999年 - 2000年
杉本 千尋, 井上 昇, 藤崎 幸蔵, 長澤 秀行, 福士 秀人, 高井 伸二, 大橋 和彦, 小沼 操
ある種の動物、人の病原体は野生動物社会と人間あるいはその飼育動物社会との間を往来し、種々の疾病を引き起こす。本研究では野生動物と人間、家畜が密に接触する機会の多いアフリカをフィールドとして、原虫、ウイルス、細菌を含む各種病原体を家畜・野生動物、あるいは生息環境(土壌)から分離し、遺伝子解析から生物学的、生態学的障壁を乗り越え、病原体が宿主域を広げてゆけるのか検討した。
ウシあるいはヒツジのTheileria原虫は大きく、良性タイレリア群と強病原性タイレリア群に分類されるが、野生動物由来のタイレリア種はこれら反芻家畜由来のタイレリア群とは系統進化的には離れていた。ウシ由来タイレリア原虫に関して、rRNA遺伝子塩基配列から個体毎の感染状況を検査した結果、Theileria oroentalisなど4種が混在していることが明らかにされた。
馬飼育地の土壌からRhodococcus equiを分離し、強毒プラスミド保有株の存在を確認したが、そのタイプは欧州の馬から分離される型と同一であった。このことは強毒プラスミド保有株が欧州から持ち込まれ、南アの自然環境に定着したと考えられる。ヘルペスウイルスに関しては、DNAポリメラーゼを標的とするPCRにより、5種のレイヨウおよびサイからウイルス遺伝子が検出された。インパラ由来ヘルペスウイルスはウシなどの反鯛家畜由来ヘルペスウイルスとはかなり類縁性が低いものであった。
以上のように、以上調査した病原体は宿主と共進化を遂げてきたと考えられ、アフリカの様に野生動物と家畜が密に接触しうる環境下でも、あらゆる病原体が「種の壁」を自由に乗り越えることによって新たな宿主を獲得し進化を遂げてきたとは考えにくいと結論づけられた。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 11691164

タイレリア原虫遺伝的多様性獲得の分子機構と疾病制御
科学研究費助成事業
1999年 - 2000年
小沼 操, 大橋 和彦, 杉本 千尋
ウシ小型ピロプラズマ症はTheileria sergenti原虫の赤血球内寄生による貧血および発熱を主徴とする疾病である。本原虫は宿主体内で巧みに免疫を回避している事ならびにダニ体内で有性生殖により組み換え等をおこし遺伝的多様性を獲得している可能性などにより制圧が困難となっている。本原虫のピロプラズム表面には分子量32kDaのピロプラズム主要表面蛋白質(MPSP)が発現しており、宿主免疫の標的となっている。MPSPは遺伝的・抗原的多型性がありそれが本原虫の持続感染に関連しているのではないかと考えられている。
これまでにT.sergenti原虫染色体は4本に分離されることを明らかにし、原虫遺伝子(p23,p32,HSP70など)の染色体マップを行ってきた。本研究はタイレリア原虫の遺伝的多様性を解析する目的で原虫遺伝子の解析が最も進んでいるT.parvaでまず解析を行いその結果をT.sergentiに利用しようと考え、ケニアのILRI研究所と共同研究でT.parvaの遺伝子解析を行った。まず手始めにT.parvaで形質転換したウシT細胞株で発現しているexpressed sequence tags(ESTs)の解析を行った。その結果394cDNAクローンの塩基配列を決定しGene Bankのデーターベースとの相同性を比較した。141クローンはデーターベースとのデーターと相同性を示し、このうち47クローンはヒトの配列と、19はウシの配列と相同性を示した。126クローンはいずれとも相同性を示さず新しい遺伝子と考えられる。
次にシゾントのステージの原虫で発現している原虫遺伝子についてEST解析を行った。461cDNAの塩基配列を決定し、これをT.parvaの4本の染色体上にマップした。20クローンは33 Sfil断片にマップされた。この解析結果は単にT.parvaの遺伝子解析のみならずタイレリア原虫全般の遺伝子解析に重要な知見を提供している。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 11460141

赤血球寄生原虫集団の分子生態学的研究と生物学的多様性獲得機序の解明
科学研究費助成事業
1998年 - 2000年
杉本 千尋, 五十嵐 郁男, 藤崎 幸蔵, 長澤 秀行, 井上 昇, 大橋 和彦, 小沼 操
牛小型ピロブラズマ原虫(Theileria orientalis)感染においては、ピロプラズマ主要表面蛋白質(MPSP)の遺伝子型を異にする多種類の原虫集団が持続感染経過で交互に出現する現象が観察される。個体レベルでの混合感染あるいは単独感染における原虫集団動態の解析は、病態解析や疾病制御上極めて重要な情報を提供する。本研究では効率的に原虫集団解析を行う技術を開発することにより、原虫の免疫回避現象や持続感染機序を解明し、個体内に存在する原虫相の解析を行うことを目的に本計画を実施した。
MPSPの遺伝子型を効率的に区別できる変性ゲル電気泳動法について各種条件について検討を行い、C型原虫亜集団の解析が可能な系を確立した。さらに複数種の混在が予想される感染材料(牛あるいはスイギュウ)について、リボソーマルRNA遺伝子を標的とするPCRにより、感染血液中に存在するタイレリア原虫種の同定し、T.buffeliなど4種の混在状態を確認した。また、T.parva感染リンパ球に由来するcDNAライブラリーを解析し、461クローンの部分塩基解析を行い、いくつかの遺伝子について染色体上にマッピングすることに成功した。
また、ダニ/宿主/原虫の3者が接触する場面であるダニ唾液(腺)に焦点を当て研究を行った。唾液腺に存在する分子の性状を免疫・蛋白質化学あるいは分子生物学的に分析し、数種類の唾液腺分子(セメント蛋白質、蛋白分解酵素ならびにその阻害因子など)についてその性状を明らかにすることができた。これらの中には宿主の特異、非特異的生体防御系と反応し、原虫感染を助長すると考えられる因子が存在した。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 10460126

植物発現系によるサイトカイン製剤の開発と家畜疾病制御への応用
科学研究費助成事業
1998年 - 1999年
杉本 千尋, 上田 一郎, 大橋 和彦, 小沼 操, 松村 健
本研究の目的は植物発現系で活性のある動物生理活性蛋白質を発現させ、その活用の道を開発することにある。そこで植物形質転換技術と植物ウイルスベクター系により外来遺伝子の植物での発現を試みた。
まず、アグロバクテリウムによる形質転換技術により人インターフェロン(INF)α2bおよびIFN8cDNAをジャガイモに導入し、遺伝子発現をノーザンブロットおよび抗INFモノクローナル抗体による酵素抗体法により確認した。INFα8cDNA導入個体については、10-500国際単位/gのIFN活性が検出され、生物学的活性を保持した分子の発現が確認された。
牛白血病をモデルとして病態にサイトカインが関与するのかを解析、ウィルス血症の制御にはTNFαが深く関与していることを明らかにした。獣医領域のワクチン開発の素材となる分子として、ダニ唾液腺抗原遺伝子、セリンプロテアーゼ遺伝子、牛小型ピロプラズマ原虫表面抗原遺伝子のクローニングを行った。今後これらの分子を発現する植物体を開発することにより、有効な動物疾病制御法が開発できるものと思われる。
クローバー葉脈黄化ウイルスゲノムに対するcDNAを、35S植物転写用プローモーターの下流に連結して、感染性を保持する大腸菌プラスミドをpClYVVとして植物ウイルス発現ベクターとし構築した。このベクターで外来遺伝子(Green Fluorescent Protein:GFP)遺伝子を組み込み、その発現を確認した。さらに、本ウイルスベクターにIFNα8cDNAを組み込み、感染性ウイルスを作製し、ソラマメに感染させ、導入遺伝子発現をELISAで検討したが、陰性であった。回収されたウイルスの遺伝子解析の結果、組み込んだINFcDNAが脱落しており、本遺伝子が植物ウイルスベクターに安定的に保持されないことが判明した。今後、導入遺伝子の安定性を高めたベクター開発が必要となろう。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 10556067

南アジアに分布するタイレリア原虫の分子系統進化
科学研究費助成事業
1998年 - 1999年
小沼 操, 大橋 和彦, 辻 正義, 杉本 千尋, 高橋 英司
タイレリアのうち病原性の比較的弱いT.sergenti/buffeli/orientalis群の原虫はアジア・オーストラリア・ヨーロッパに広く分布している。
初年度は韓国南部と済州島でタイレリア原虫を採集し、そのDNA解析を行った。その結果、済州島では病原性の比較的強い、I型が主体を占めていた。南アジアについてはカンボジア、タイ、インド、パキスタンを訪問し、それぞれ現地の研究者の協力で原虫を採集し、そのDNA解析を行った。タイではI型とC型原虫が分布していることを明らかにした。インド、パキスタンではT.annulataが主体であるため、水牛より材料を得て、タイレリア原虫の検出を行っているが、今のところ陽性例は得られていない。カンボジアについてはKongpong speuより56サンプル、Ratanakiriより81サンプルを得た。Kongpong speuでは、22株でC型とThai型原虫が混在していた。また19株でThai型が、2株でC型のみが検出された。Ratanakiriの材料では8株からC型とThai型の混在が、15株にThai型が、4株にC型のみが検出された。この成績はタイでの成績とよく一致していた。
11年度は、南アジアのうちベトナム・タイ・カンボジア・中国南部(雲南)について原虫の分離を行った。7月にタイの共同研究者がタイ分離のタイレリア原虫DNAを持参したため、このDNAを解析した。8月にはベトナムとカンボジアを訪問し、多くの原虫DNAと血清を採集した。帰国後、原虫DNAを解析しているが、カンボジア・ベトナムのタイレリア原虫はタイに分布している原虫(Thai型)と類似の原虫と、日本に分布しているC型原虫が分布している事が明らかとなった。11月に中国・雲南省に採材に行ったが毎日雨で計画のようには原虫が採集できなかった。
これら2年の調査で、南アジアのうちタイ・ベトナム・カンボジアに分布するタイレリア原虫はThai型とC型が主であることが明らかとなった。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 10041150

マレック病腫瘍化におけるアポトーシス関連及び癌抑制遺伝子の発現動態の解析
科学研究費助成事業
1998年 - 1999年
大橋 和彦
マレック病ウイルス(MDV)の腫瘍化における発癌抑制遺伝子やアポトーシス関連遺伝子の役割を解析するため、特にbcl-2、bcl-x遺伝子に関して検討した。そしてこれまで、1)マレック病腫瘍株化細胞、MSB1、MTB1やMDV感染鶏由来CD4^+T細胞においてはアポトーシス抑制遺伝子であるbcl-2遺伝子の発現が抑制されていること、2)しかしbcl-2同様にアポトーシスを抑制するbcl-xLが代償的にMSB1.MTB1では発現していることが判明した。これらのことはMDVによる腫瘍化(少なくとも腫瘍化の維持)にはbcl-2よりもbcl-xL遺伝子の発現がより大きく寄与していることを示唆している。しかしながら、可移植性マレック病腫瘍株化細胞、RP1、HP1等ではbcl-2遺伝子の発現が認められ、bcl-2遺伝子が腫瘍の悪性化(腫瘍株の可移植性を指標として)に関与していることも示唆された。そこでbcl-2遺伝子の可移植性に対する役割を検討した。PCR法にて鶏bcl-2α遺伝子cDNAをクローニングし、ネオマイシン耐性マーカーを持つ真核細胞発現ベクター(pCIneo)に組み込み、bcl-2遺伝子を発現していないMSB1細胞に遺伝子導入してbcl-2遺伝子発現MSB1細胞を樹立した。bcl-2遺伝子の発現はノーザンブロット法にて確認した。そして現在、この細胞をマレック病感受性鶏の翼下皮下に接種して可移植性が付与するかどうかを検討している。
さらにMDV感染鶏由来CD4^*T細胞における他のアポトーシス関連遺伝子、DAD1、ITA、p58等の発現をノーザンブロット法で検討したが、対照鶏との間に有意な差は認められなかった。今後さらに腫瘍株化細胞における発現を検討する。
日本学術振興会, 奨励研究(A), 北海道大学, 09760262

サイトカインによる免疫系の修飾と感染症の制御
科学研究費助成事業
1997年 - 1999年
小沼 操, 桐沢 力雄, 渡来 仁, 杉本 千尋, 大橋 和彦, 屋代 真彦
サイトカインはホルモン同様、生命維持に不可欠な細胞間情報伝達物質である。ヘルパーT(Th)細胞は抗原情報を受けると分裂・増殖し、各種サイトカインを放出して免疫系を動かし微生物の排除を行う。放出されるサイトカインにより病態が全く異なることが知られている。今回、サイトカイン発現と病態の解折としてウシ白血病ウイルス(BLV)感染にともなう宿主の免疫応答を理解するために、BLVエンベロープ抗原のヘルパーT細胞エピトープとして報告されているペプチド61、および98をヒツジに免疫し、誘導される免疫反応を検討した。
その結果61、98各ペプチドはヒツジの末梢血リンパ球(PBMC)に対し増殖反応を誘導するが、全く性質の異なる細胞集団を誘導した。ペプチド98刺激では一般的なヘルパーT細胞の性格を示した。すなわち、CD4陽性細胞がMHCクラスIIにより表出するペプチドを認識した皮応であり、産生されるサイトカインプロファイルの解折から、Th1型細胞を特異的に誘導していることが示唆された。これに対し、ペプチド61により誘導される細胞集団は、CD8陽性細胞、およびMHCクラスII陽性細胞であり、タイプ2サイトカインを産生する細胞集団であった。
ペプチド免疫後BLV攻撃前、およびBLV攻撃後2週目のPBMCについて競合的PCR法を用いてサイトカイン遺伝子の発現を調べた。検討した腫瘍壊死因子(TNF)を除くほぼすべてのサイトカインでBLV攻撃によりサイトカイン産生能の低下が認められた。TNF産生能については他のサイトカインと異なる特徴的な反応性を示した。すなわちBLV増殖を抑えたヒツジではBLV感染によってTNF産生の促進が認められ、ウイノレス増殖したヒツジではTNF産生能が低下していた。これはTNFαが抗ウイルスに作用していることを示唆している。
BLVエンペロープのペプチド98免疫羊にBLV攻撃するとBLV抗原に対して、幼若化反応を示す個体はウイルスが排除された。しかし免疫後BLV抗原に対する幼若化反応を示さない羊でもウイルスを排除し、それらの羊ではTNFαmRNAの発現亢進がみられた。BLVが排除された抵抗性羊と、BLVが排除できず多くのウイルスがPBMCから検出された感受性羊の両群(BLV攻撃後3年余を経過)の羊でのTNFレセプター(R1),TNF R2の発現を調べた。BLV抵抗性、感受性羊のPBMCにおけるBLVの検出とTNFαおよびTNF R1,R2 mRNAの発現パターンをみたところ、抵抗性羊ではPBMCからの分離ウイルスは少なく、TNFαならびにTNF R1 mRNA発現は、感受性羊にくらべ、それぞれ2〜3倍と3〜8倍の亢進がみられた。一方、TNF R2については差は認められなかった。BLVの腫瘍株(Ku1)についてそのレセプター発現をみたところ、R2のみが発現しておりR1は検出限界以下であった。次ぎに組換えTNFα添加によるPBMCの増殖について検討した。その結果、抵抗性羊ではほとんど増殖反応がみられなかったが、感受性羊ではTNFα添加による細胞増殖が認められた。これらの成績から1)BLV抵抗羊ではTNFαとTNF R1 mRNAの高発現によりウイルス感染細胞を排除している。2)感受性羊や白血病の細胞ではTNF R2が高発現しており、TNFαが増殖因子としてTNF R2に作用し病態形成と関係している事が示唆された。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 09356009

タイレリア原虫のゲノム解析
科学研究費助成事業
1997年 - 1998年
杉本 千尋, NENE Vishnas, BISHOP Richa, MORZARIA Sub, 大橋 和彦, 小沼 操, VISHNASH Nen, RICHARD Bish, SUBHASH Morz
本研究はタイレリア原虫のゲノム構造の一端を明らかにし、種分化におけるゲノムの構造変化の解析、ワクチン開発上の有用遺伝子の探索などに有能な情報をゲノムサイエンスから得ることを目的としてきた。
まず、Theileria parvaのcDNAライブラリーから得られたクローン計800クローンの塩基配列情報を得た。これらのうちいくつかは染色体上にマッピングし、expressed sequence tagとして有効に利用できることが判明した。各塩基配列について、BLASTSEARCHにより既知遺伝子配列との相同性を解析した。また、50-200キロベースのT.parvaゲノム断片を含むBacterial artificial chromosome(BAC)ライブラリーを作製した。ライブラリーは約3600クローンがらなり、T.parvaの全ゲノムをカバーするものを作製し得た。また、スポロゾイト表面抗原遺伝子など原虫増殖に重要な遺伝子を含むBACクローンを特定できたことから、その周辺のゲノム構造解析が可能となった。
T.sergentiについては染色体が4本であること、各染色体サイズとそれぞれを合計したゲノムサイズ(約10Mb)とT.parvaのそれと一致することを確認した。さらにいくつか遺伝子を各染色体上にマッピングしT.parvaと比較したところ、両種の原虫間では一部シンテニーが保存されておらず、染色体構造が一部異なることが示唆された。
タイレリア原虫の全ゲノム構造を明らかにするにはさらに研究を進める必要があるが、多くのESTが得られたこと、また有用なBACライブラリーが樹立できたことにより、今後タイレリア原虫およびその類縁原虫のゲノム解析の基盤が本研究により築かれた。
日本学術振興会, 国際学術研究, 北海道大学, 09044199

タイレリア原虫の免疫回避の分子構造の解明
科学研究費助成事業
1995年 - 1998年
小沼 操, 大橋 和彦, 杉本 千尋
Theileria sergentiのピロプラズマ主要表面抗原(p32)には池田型(I-type)、千歳型(C-type)、オーストラリア型(B-type)の大きく3種に大別されることが、今までの研究から明らかにされている。世界各国に分布する良性タイレリア原虫株には、この3種の表面抗原型を持つ原虫が混在しており、原虫の生存にとって、表面抗原の多様性が何らかの重要な意義を持っていると考えられている。各型間では抗原性に違いが見られることから、原虫集団の置き換わりによる抗原変換あるいは遺伝子構造の変化による抗原変異が免疫回避と何らかの関連を持っていることが推測された。我が国の牛小型ピロプラズマ感染症の疫学解析、ワクチン開発の上で、はたして表面抗原遺伝子に変異が起こるのか、また感染個体内にどの程度の表面抗原多様性を持つ集団が存在するのかなどを明らかにすることが極めて重要である。
この研究を通じ、無性生殖で増える赤内型原虫は牛体内では免疫プレッシャーはあるが原虫の表面抗原が変異をおこし免疫回避をしているとは考えにくいことが明らかとなった。原虫はダニ体内では有性生殖をおこし増殖する。ダニ体内で有性生殖で増殖する間に遺伝的に異なった原虫間で組換え等により原虫の遺伝的多型性が生ずると考えられる。このダニ体内での原虫遺伝子の組換え等を証明するためT.sergentiの染色体解析と原虫既知遺伝子の染色体上での位置を決定した。これにより生物学的にクローン化した遺伝的に異なる原虫(C型とI型)が同一ダニ体内で有性生殖の間に染色体の組換えが起こるか否か実験することが可能となった。本研究によりダニ媒介性病原体の多型性獲得の機序、それによる免疫回避について分子レベルでの解析を可能にした。
日本学術振興会, 基盤研究(A), 北海道大学, 07406019

原虫の宿主細胞内環境への適応とその排除機構の解明
科学研究費助成事業
1996年 - 1997年
杉本 千尋, 大橋 和彦
核酸生合成系の酵素として重要なRibonucleotide reductaseを構成する2つのサブユニットのうち、小サブユニット(R2)遺伝子のクローニングを行った。T.sergenti牛感染血液からピロプラズマを精製、mRNAを得た。既に塩基配列の知られているT.annulataR2遺伝子からプライマーを設計し、RT-PCRにより遺伝子増幅した。得られたcDNA断片は全長を含んでいなかったため、5‘、3'方向へRACE(rapid amplification of cDNA ends)法によって全長cDNAを得た。さらにcDNA断片をプローブとして染色体DNAライブラリーをスクリーニングして、R2遺伝子領域を含むクローンを得た。その塩基配列解析の結果、R2遺伝子には少なくとも2カ所のイントロンが存在することが判った。予想アミノ酸配列のC末端(R1サブユニットとの会合部位)は、宿主のR2分子の構造とは異なっており、合成ペプチドによる阻害が可能であると考えられた。
赤血球侵入に際し赤血球レセプター結合と結合する蛋白質の遺伝子クローニングをB.equi,B.caballiについて行った。すなわち両原虫のcDNAライブラリーから、抗体を用いた免疫スクリーニングによって、前者からは2クローン、後者からは1クローンを得た。塩基配列決定の結果、B.equiの1クローンはグルタミン酸の連続するモチーフを持つ蛋白質蛋白質で、マラリア原虫の表面蛋白質とも構造が共通するものであった。また、B.caballiの1クローンは、赤血球侵入に重要な役割を果たすロプトリ-関連蛋白質であることが判明した。
T.sergentiveilについて、いくつかのバンドを単離してN末端アミノ酸配列を決定したところ、いずれも宿主の蛋白質とのホモロジーは認められず、原虫由来蛋白質であると考えられた。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 08456143

環太平洋地域に分布するタイレリア原虫の分子系統進化
科学研究費助成事業
1996年 - 1997年
小沼 操, 大橋 和彦, 辻 正義, 杉本 千尋
タイレリアのうち病原性の比較的弱いT.sergenti/buffeli/orientalis群の原虫はアジア、豪州およびヨーロッパと広く分布している。日本のT.sergentiとそれら外国、特に環太平洋地域に分布している原虫との分類学的関連については不明であった。そこで一昨年、昨年と2年にわたり豪州、アメリカ、中国、タイ、台湾などより現地の研究者の協力のもとに原虫を採集し、解析した。解析の方法は原虫の主要表面抗原(p32)遺伝子型よりC,I,B-1,B-2型に分けられそれらに特異的なプライマーを設定しPCR法で増幅し、型別を行った。今年度は特にイタリア、タイ、中国の分離株について解析した。その結果、これまでイタリアの原虫はT.orientalisと言われていたが、この原虫にはC型とB-1型の原虫が混在しており豪州の分離株と全く同一であった。タイの分離株にはC型、B-1型以外に、我々がT.sergenti/buffeli/orientalis増幅用に用意したプライマリ-では増幅できない原虫が含まれていた。そこでこれら原虫の主要表面抗原遺伝子の塩基配列より特別なプライマーを設定し、PCRを実施した。その結果このタイの分離株にはC型、B-1型とは異なる未分類のTheileria sp.が含まれていた。このTheileria sp.と類似の原虫はタイ以外に中国、米国の分離株からも検出された。これらの成績は3つの論文として公表し、他の1つは投稿中である。
日本学術振興会, 国際学術研究, 北海道大学, 08041130

ディファレンシャルデスプレイ法による鶏免疫関連分子の解析と病態変化への応用
科学研究費助成事業
1996年 - 1996年
大橋 和彦
活性化された鶏胸腺細胞に発現するマーカーやサイトカイン及びその受容体遺伝子をディファレンシャルデスプレイ法により同定し、分子クローニングにより遺伝子構造を解析するとともに、その生物活性を保持した組み換え蛋白質の大量調製法を確立し、将来的にはワクチンとは異なった免疫賦活作用による家畜の感染防御法の開発に応用することを目的として行った。
マレック病ウイルス感染あるいは非感染の若齢鶏(0日〜14日齢)の胸腺を細切して浮遊細胞を調製してPMA及びIonomycin存在下で培養を行った。この操作で胸腺細胞の活性化あるいはアポトーシスを誘導することができる。なお薬剤存在下の培養時間は予備試験を行い12〜24時間と決定した。そして処理及び未処理の胸腺細胞より全RNAを抽出(Trisolを用いる)した後オリゴdTスピンカラムを用いてmRNAを精製した。
RNA map Kit (GenHunter社)を用いて、4群のオリゴdTプライマー(各塩基+dT)を用いて逆転写反応を行いcDNAクローニングを得た後、任意に設計された20種類の10merランダムプライマーと4群のオリゴdTプライマーを用いて標識dATP存在下でPCRを行った。この反応により理論的に相当種類(数千〜数万)のmRNAを増幅することができる。得られたDNAはポリアクリルアミドゲル電気泳動法後オートラジオグラフィーにより解析したが、薬剤未処理のものと処理のもので異なったパターンを示すDNA断片を数十個同定し、ゲルより切断後さらにDNAを任意のプライマーを用いて増幅した。現在これらのクローンが薬剤処理前後で発現パターンが変化するかどうかをノーザンブロットで検討している。
日本学術振興会, 奨励研究(A), 北海道大学, 08760268

熱帯アフリカにおけるタイレリア感染症の分子疫学的調査:家畜および野生動物に寄生する原虫の性状検討
科学研究費助成事業
1995年 - 1996年
杉本 千尋, 大橋 和彦, 小沼 操
牛由来Theileria Parvaのシゾント感染リンパ球株樹立と性状解析(主にザンビア大学、国際家畜研究所との共同調査・研究)
ザンビア国内5地域の農場に飼育されていた東海岸熱(ECF)罹患牛から試料を得て原虫株分離を試みた結果、中部州(Kabwe)農場の2検体からシゾント感染細胞が樹立できた。これら2株をケニア(IRLI)に搬入し、Southern Provinceから既に樹立されていた株(Mazabuka株)と合わせDNAプローブによるサザンブロット解析ならびにモノクローナル抗体による間接蛍光抗体法により性状検索を行った。Mazabuka株は、その免疫学的、遺伝学的性状がケニアの牛から分離されたMuguga株(いわゆるT.parva parva)のそれと極めて類似しているが、既知のアフリカバッファロ-由来の原虫型(いわゆるT.parva lawrencei)とは明らかに異なっていることが明らかとなった。このことから,ザンビアの中部/南部州に存在するT.parvaは、牛間で伝播する原虫と考えられた。さらに、中部/南部州由来株と東部州由来株とは明らかに諸性状を異にしていることも明らかにできた(Nambota et al,1996)。また、ピロプラズマとシゾントステージに発現される表面蛋白質(p32およびPIM)遺伝子の解析をPCR-RFLPで行った結果からも、以上の成績が裏付けられた。
T.parva以外の野生動物由来タイレリア・バベシアの比較(主に南ア獣医学研究所との共同調査・研究)
(1)アフリカバッファロ-由来原虫種の遺伝子解析
前年度南アのバッファロ-から得られた原虫DNA試料から、rRNA遺伝子ならびに主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32)遺伝子をPCRにより増幅し、その塩基配列を決定した。rRNA遺伝子解析の結果から、バッファロ-血液試料中には、T.parva以外に少なくとも3種のタイレリアの存在が確認された。それらのうち1種は、牛由来良性タイレリア種(T.buffeli)と同一であり、牛-バッファロ-間の感染が成立しているものと考えられた。他2種はバッファロ-固有種と考えられ、牛との間での感染の成立はないと考えられた。それらのうち、1種のrRNA遺伝子塩基配列は既知のタイレリアのそれとは全く異なっており、新種と考えられた。また、バッファロ-固有種の主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32)の遺伝子解析から、本種はアジアで見られる牛寄生性良性タイレリアの一群とはやや遺伝学的に離れたところに位置づけられた(角田ら、投稿中),ザンビアで採取したバッファロ-血液DNAからは既存のプライマーによるPCRでは増幅産物は得られなかった。
(2)その他の動物における原虫感染状況の調査
タイレリア感染の見られたセ-ブルアンテロープから樹立されたシゾント感染細胞試料からDNAを得て、遺伝子解析を行った。本種は既にrRNA遺伝子塩基配列から固有種と考えられているが,今回の主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32相同分子)の遺伝子解析の結果からも、既知の牛由来タイレリア種とは全く独立した位置づけにあることが確認された(角田ら,印刷中)。
猫科動物(ライオン、チ-タ、カラコル[野生猫の一種])の末梢血液の塗抹標本においてタイレリアもしくはバベシアと考えられる原虫を検出した。これらの多くは未記載、未分類の原虫であり、さらにrRNA遺伝子解析を継続して行い、既知の種との遺伝的関係を明らかにする必要がある。
馬科動物においては、シマウマ末梢血液中にバベシア原虫を検出し、5株についてはその試験管内培養に成功した。これらは、形態学的にウマ由来のBabesia equiと同一原虫種と考えられた。南アのウマ由来Babesia equiについては、主要ピロプラズマ表面蛋白質(EMA-1)遺伝子の解析から、少なくとも4つの遺伝型が存在することが今回の調査で明らかになった。(須藤ら、印刷中)。今調査研究内では、馬由来株との遺伝学的な比較をさらに行うには至らなかったが、野生動物が共存する地域でのウマピロプラズマ感染症の疫学を明らかにする上で、EMA-1遺伝子解析をさらに行う必要がある。
日本学術振興会, 国際学術研究, 北海道大学, 07041119

鶏CD4:CD8遺伝子のクローニングによるマレック病ウイルスの癌化標的細胞の解析
科学研究費助成事業
1995年 - 1995年
大橋 和彦
鶏CD8遺伝子ついては研究期間中に別のグループによりα、β鎖の塩基配列が決定された(Tregaskes et al.,J.Immunol.154:4485-4494,1995)。そこでこの塩基配列より、α、β鎖のORFを増幅するようなプライマーをデザインして既に調製しておいた鶏脾臓由来cDNAを用いてPCRを行い増幅された断片を直接クローニングした。クローニングした断片は制限酵素による切断試験でCD8 αおよびβ鎖であることを確認した。そしてこのCD8 αおよびβ鎖遺伝子をプローブとしてマレック病ウイルス(MDV)感染鶏から得られた脾臓や末梢血リンパ球中のCD8^+T細胞におけるCD8遺伝子の転写レベルを測定した。その結果、非感染対照鶏に比べMDV感染鶏ではCD8遺伝子の転写が著しく低下していることが示された。なお、CD8分子の発現低下はモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーでも示されておりMDV感染鶏におけるCD8分子のDown-regulationは転写レベルで起こっていることが示された(Morimura et al.,J.Gen.Virol.in press,1995;Morimura et al.,国際獣医免疫シンポジウム、Davis,USA,1995)。現在はCD8 αおよびβ鎖遺伝子を各々大腸菌で発現させて得られた融合蛋白質を用いて種々の抗CD8モノクローナル抗体が認識する鎖を決定中である。
CD4遺伝子については未だ塩基配列の報告がないので現在までクローニングされた人、マウス、サル、犬等のCD4遺伝子間で相同性が高い部分からプライマーをデザインしてPCRを行い増幅されたDNA断片を直接クローニングしてその塩基配列を決定した。現在まで数種のクローンの塩基配列を決定したが他の動物CD4遺伝子と高い相同性を示すようなクローンは得られていない。今後この方法を継続すると同時にcDNAクローンを大腸菌または培養細胞で発現させ抗CD4モノクローナル抗体を用いてクローン選択する発現クローニングを行う予定である。
日本学術振興会, 奨励研究(A), 北海道大学, 07760271

鶏Fas抗原遺伝子のフローニングによるマレック病ワクチンの作用機序の解明
科学研究費助成事業
1994年 - 1994年
大橋 和彦
現在鶏Fas遺伝子のクローニングを進めている。2日齢鶏の胸腺よりフェノール・グアニジン法により調製したRNAを用いてcDNAライブラリーを調製した。ライブラリーの作成には発現ファージベクターであるλEX/loxを用いた。このライブラリをジゴキシゲン(DIG)標識したマウスFas cDNAを用いてプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングして(約400,000プラーク)鶏Fas遺伝子cDNAのクローニングを試みた。ハイブリダイゼーションの条件はFas遺伝子が既にクローニングされているヒト、マウス、ラットにおいてもお互いの相同性約65%と低く、鶏ではさらに相同性が低いことが予想され、約55%の相同性を想定した。スクリーニングの結果、数種類の陽性クローンが得られ、2次および3次クローニングを行い、最終的に5個のcDNAクローンを得た。
また同時に上記の方法で鶏胸腺の他、脾臓、マレック病腫瘍由来株化細胞(MSB1)よりcDNAを調製して、ヒト、ラット、マウスFas遺伝子で相同性の高い塩基配列よりデザインしたプライマー(5′-GACCCAGAATACCAAGT-3′及び5′-TTCTGCTGTGTCTTGGA-3′)を用いてPCR法により鶏Fas遺伝子の増幅を試みた。その結果、サイズの異なる3種類の特異的バンド(約700〜300塩基対)が得られ、これらをpGEM-Tベクターに組み込んだ。
今後、これらの塩基配列を決定するとともに、これらのクローンをプローブとしてFas遺伝子の完全長を含むcDNAクローンをライブラリーよりスクリーニングする予定である。さらにゲノムを用いたPCR法によるクローニングも行っている。
日本学術振興会, 奨励研究(A), 北海道大学, 06760252

マレック病ウイルスによる腫瘍化の分子メカニズムの解析、ワクチン作用機序の解明　　　　　　　　　　　　　　　
1992年
競争的資金

動物感染症に対する免疫応答の分子機序の解明　　　　　　　　　　　　　　　
1992年
競争的資金

Characterization of molecular mechanisms of immune responses against infectious diseases in animals　　　　　　　　　　　　　　　
1992年
競争的資金