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Search Details

Uchida Takeshi

Faculty of Science　Chemistry　Physical ChemistryAssociate Professor

Researcher basic information

■ Degree
  • 博士（工学）, 京都大学
■ URL
researchmap URLホームページURL■ Various IDs
Researcher number
  • 30343742
J-Global ID■ Research Keywords and Fields
Research Keyword
  • シトクロムc
  • 転写制御
  • ラマン分光法
  • ヘム
  • 酸化還元
  • 病原菌
  • 共鳴ラマン
  • 水素結合
  • 時計蛋白質
  • チオエーテル結合
  • チオエーテル結
  • ヘムタンパク質
  • 翻訳後修飾
  • DNA結合
  • 鉄
  • 蛋白質
  • NPAS2
  • NPAS
  • 酵素
  • 生体分子
  • シグナル伝達
  • シトクロム酸化酵素
  • センサー蛋白質
  • 酸化修飾
  • ヘム生合成
  • 共鳴ラマン分光
  • ナノディスク
  • ROS
  • 酸素センサー蛋白
  • 回転半径
  • 生物無機化学
Research Field
  • Nanotechnology/Materials, Fundamental physical chemistry
  • Nanotechnology/Materials, Bio chemistry
  • Life Science, Biophysics
  • Life Science, Functional biochemistry
  • Life Science, Structural biochemistry
■ Educational Organization

Career

■ Career
Career
  • Jun. 2013
    Hokkaido University, 理学(系)研究科(研究院), 准教授
  • Apr. 2001 - Oct. 2001
    岡崎国立共同研究機構分子科学研究所, 学術振興会特別研究員
  • Oct. 1999 - Mar. 2001
    アルバートアインシュタイン医科大学, 博士研究員
  • Apr. 1998 - Sep. 1999
    岡崎国立共同研究機構分子科学研究所, 大学等非常勤研究員
  • 1998 - 1999
    Part-time researcher for university or other academic organization
Educational Background
  • 1998, Kyoto University, 工学研究科, 分子工学専攻, Japan
  • 1998, Kyoto University, Graduate School, Division of Engineering
  • 1995, Kyoto University, 工学研究科, 分子工学専攻, Japan
  • 1995, Kyoto University, Graduate School, Division of Engineering
  • 1993, Kyoto University, Faculty of Engineering, 石油化学科, Japan
  • 1993, Kyoto University, Faculty of Engineering

Research activity information

■ Awards
  • 2009, 日本化学会北海道支部奨励賞
    Japan
■ Papers
■ Other Activities and Achievements
■ Books and other publications
  • Heme binding characteristics of mouse PER1, a transcriptional regulatory factor associated with circadian rhythms
    Nova Science Publishers, 2011
■ Syllabus
  • 生物化学Ａ（Ⅲ）, 2024年, 修士課程, 総合化学院
  • 大学院共通授業科目（一般科目）：自然科学・応用科学, 2024年, 修士課程, 大学院共通科目
  • 生命分子化学特論, 2024年, 修士課程, 総合化学院
  • 生命分子化学特論, 2024年, 修士課程, 工学院
  • 生命分子化学特論, 2024年, 博士後期課程, 工学院
  • 一般教育演習(ﾌﾚｯｼｭﾏﾝｾﾐﾅｰ), 2024年, 学士課程, 全学教育
  • 分子分光学, 2024年, 学士課程, 理学部
■ Affiliated academic society
  • 日本生物物理学会
  • 日本化学会
  • 日本生化学会
  • 日本蛋白質科学会
■ Research Themes
  • Environmental pollutant degradation system using dye-decolorizing peroxidase
    Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Apr. 2020 - Mar. 2023
    内田 毅
    DyP (Dye-decolorizing peroxidase) はヘムを含むペルオキシダーゼという酵素タンパク質の一種で、過酸化水素を利用し、アントラキノン系の色素を分解する酵素であることから、環境浄化酵素としての利用が期待されている。しかし、微生物やカビなどの一部に存在するタンパク質であるにもかかわらず、それらの生育条件とは離れたpH 4程度の酸性条件で活性が高く、中性付近ではほとんど活性がないという特徴が、環境浄化酵素としての実用化へのハードルとなっていた。そこで、反応機構を明らかにすることにより、pH依存性を決定している因子を明らかにし、アミノ酸置換を導入することにより、中性pHで活性を持たせることに成功した。試験管内の反応では中性で色素を分解可能になったため、これを大腸菌に発現させ、大腸菌を培養しながら、溶液内の色素を分解することを試みた。しかし、予想外に活性は著しく低く、環境浄化酵素として利用することでできなかった。原因を検討した結果、菌体内で発現させると活性中心であるヘムと結合していないことがわかった。ヘモグロビンなど多くのヘムタンパク質ではヘムはタンパク質と配位結合しているため、大腸菌内で利用しようとするとヘムを含まない可能性がある。そこで、タンパク質とヘムが共有結合しているシトクロムcにDyP活性を付与することを試みた。
    はじめに天然型のシトクロムcのDyP活性を測定したところ、DyPの1/2程度の活性であることがわかった。次に、DyPで明らかにした反応機構をもとにシトクロムcに色素分解に必要なアミノ酸残基を導入することにより、天然型のシトクロムcの80倍の活性をもつ変異体シトクロムcを作成した。また、至適pHは8.0付近であったことから、試験管レベルではあるが、環境浄化酵素としての利用が期待できるものの作成に成功した。
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Hokkaido University, 20K05700
  • Molecular Design and Functional Regulation of Integrated Membrane-bound Protein Using Nono-disc
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    28 Jun. 2019 - 31 Mar. 2021
    Ishimori Koichiro
    We focused on nonodisc-reconstituted halorhodopsin (HR), pumping chloride ion into the cell in response to light, and bacterial cytochrome oxidase (cbb3), promoting four-electron reduction of molecular oxygen in the respiratory chain. Their structures and enzymatic activities were investigated by various kinds of spectroscopies, and the applications of these nanodisc-reconstituted proteins were examined. To facilitate the effective chloride pumping in HR, the interactions between HRs, effects of charges on the membrane, and flexibility of the membrane to tolerate the conformational changes associated with the chloride binding and releasing were found to be essential. We successfully immobilized cbb3 on the electrode and found that immobilized cbb3 can electrochemically mediate the four-electron reduction of molecular oxygen on the electrode. Further experiments are required to improve the efficiency of the reduction of molecular oxygen by using the nanodisc-reconstituted enzyme.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory), Hokkaido University, 19K22193
  • Dynamic Structural Characterization of Electron Transfer Complex in Respiratory Chain of Mitochondria and Its Electron Transfer Regulation Mechanism
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2016 - 31 Mar. 2019
    Ishimori koichiro
    One of the essential biological processes, the four-electron reduction of molecular oxygen to water molecules in the mitochondrial respiratory chain, is promoted by the electron transfer from cytochrome c, a typical heme-containing electron transfer protein, to membrane-bound cytochrome c oxidase. In this study, we examined the electron transfer reaction under the physiological conditions and revealed that the interactions between the proteins and lipids in the membrane, structural fluctuations, transient structural changes, of the proteins, the specific protein-protein interactions mediated by a few amino acid residues, and hydrophobic environment in the electron transfer pathways are the crucial factors to effectively promote the electron transfer reaction from cytochrome c to cytochrome c oxidase. These observations and discussion would contribute to the understanding of the molecular regulation mechanism for the inter-protein electron transfer reaction in vivo.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Hokkaido University, 16H04173
  • 病原菌に特徴的な鉄の取り込みタンパク質に着目した新規な抗菌剤の開発
    科学研究費補助金(基盤研究(C))
    Apr. 2016 - Mar. 2019
    内田 毅
    文部科学省, Principal investigator, Competitive research funding
  • Analysis of functional regulation of PGMRC1
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2015 - 31 Mar. 2018
    Kabe Yasuaki; UCHIDA Tsuyoshi
    Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) is a haem-containing protein that interacts with epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytochromes P450 to regulate cancer proliferation and chemoresistance; its structural basis remains unknown. Crystallographic analyses revealed that PGRMC1 forms a stable dimer through stacking interactions of two protruding haem molecules. The haem iron is five-coordinated by Tyr113. Haem-mediated PGRMC1 dimerization is required for interactions with EGFR and cytochromes P450, cancer proliferation and chemoresistance against anti-cancer drugs. This study demonstrates protein dimerization via haem-haem stacking, which has not been seen in eukaryotes, and provides insights into its functional significance in cancer.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Keio University, 15K07011
  • Functional and Structural Characterization of Electron Transfer Reactions in Mitochondria Respiratory Chain Utilizing Nanodisc
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2016
    Ishimori Koichiro; Takeshi Uchida; Tomohide Saio
    We reconstituted cytochrome c oxidase (CcO) into a biomembrane model, nanodisc, to characterize its functions in the absence of detergents. The resonance Raman spectra revealed that the reconstitution of CcO into the nanodisc increases the oxygen affinity, leading to efficient reduction of dioxygen to water molecules. To discuss interactions regulating the electron transfer (ET) reactions, we examined the cytochrome c (Cyt c) interaction site on CcO by docking simulation. Unexpectedly, electrostatic interactions do not contribute to the stabilization of the complex, but regulate the binding orientation of Cyt c on CcO. Instead, hydrophobic interactions are the primary factors to stabilize the complex, and the dehydration associated with the formation of the hydrophobic interactions is the key process to facilitate the complex formation. On the other hand, the structural fluctuations are suppressed in the CcO interaction site on Cyt c, which would also characterize the ET reaction.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Hokkaido University, 25288072
  • Structural Characterization of Subunit-Specific Isotope labelled Membrane Bound Protein
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2015
    ISHIMORI Koichiro; UCHIDA Takeshi
    To discuss the electron transfer mechanism in the respiratory chain in mitochondria, the reconstitution of an isotope labelled key enzyme, cytochrome c oxidase, into the nano-disc, a mimic of membrane in cells, has been examined, which allows us to measure the high resolution NMR spectra of the membrane-bound proteins under the physiological condition. The expression, purification and reconstitution of the bacterial cytochrome c oxidase into the nano-disc were confirmed, leading to the high resolution structural analysis of high molecular weight membrane bound proteins.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research, Hokkaido University, 25650016
  • Characterization of the proteins involved in iron uptake system of pathogen and its application to development of anti-bacterial drugs
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2012 - 2014
    UCHIDA Takeshi
    Iron is an essential element for bacteria survival. To obtain this element, bacterial pathogens utilize heme from hemoglobin in blood as an iron source, because the vast majority of iron in human body is present as heme. In this project, we found that VCA0907 (HutZ) from Vibrio cholerae is a heme-degrading enzyme. The activity of VCA0907 depends on the strength of the hydrogen bond between His170 that is a sole ligand of heme, and Asp132. We further found that VCA0908 (HutX) binds to heme with a slightly higher affinity than that of HutZ. Unexpectedly, heme, which is bound to HutX, irreversibly moves to HutZ. We concluded that heme that is transported into cytosol is captured by HutX, and then it is transferred to HutZ through the direct interaction with HutX. Finally, HutZ degrades heme to release iron, which is used for survival of V. cholerae. Because iron is an essential element, our findings lead to development of a new kind of medicine for pathogens.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Hokkaido University, Principal investigator, Competitive research funding, 24550182
  • Analysis of Interactions in High Molecular Weight Protein Complexes by Using Segment Label and Cutting-edge NMR Technologies
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2011 - 2012
    ISHIMORI Koichiro; UCHIDA Takeshi
    To develop new methodologies for structural analysis of biologically important high-molecular-weight protein complexes, applications of the segment label and new NMR techniques such as the transfer cross-saturation (TCS) and residual dipole coupling (RDC) were examined. By using TCS for the final electron transfer complex in the respiratory chain, the complex between cytochrome c and cytochrome c oxidase, we successfully determined the amino acid residues of cytochrome c directly interacting with cytochrome c oxidase.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research, Hokkaido University, 23657070
  • Structural Characterization of Heme-mediated Signaling Mechanism in Protein Regulation System
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2009 - 2011
    ISHIMORI Koichiro; UCHIDA Takeshi
    In this research project, we characterized the heme binding in Iron Response Regulator (Irr) and Iron Regulatory Protein (IRP) and examined their functional significance. We spectroscopically identified the heme binding sites of Irr and, based on the structural information, a molecular mechanism of heme-induced oxidative modification in Irr was proposed. The heme binding sites of IRP were also determined and a new mechanism for the translational regulation by binding of heme was suggested in IRP. These new findings in this research project shed new light on the functional significance of heme in vivo.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Hokkaido University, 21370040
  • Redox- and CO-dependent Transcription Mechanism by NPAS2
    Grants-in-Aid for Scientific Research(基盤研究(C))
    2008 - 2010
    Takeshi UCHIDA
    The purpose of this project is to clarify the mechanism of the redoxand CO-dependent transcription by NPAS2. By using resonance Raman technique, we found that CO can bind to heme located inside NPAS2, which leads to a small conformational change around heme peripheral groups. Such a conformational change around heme is a trigger for the protein whole structural change to modulate the affinity of NPAS2 to the target DNA.
    Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, 基盤研究(C), 北海道大学, Principal investigator, Competitive research funding, 20570121
  • 電子伝達蛋白質複合体の構造化学的解明とその会合・解離の分子機構
    科学研究費助成事業
    2008 - 2009
    石森 浩一郎; 内田 毅
    本年度に得られた研究成果の概要は以下のとおりである.
    1.シトクロム酸化酵素(CcO)の結合により誘起されるシトクロムc(Cytc)における構造変化の解明Cyt cまその電子受容体であるCcOと結合し,CcO-Cytc電子伝達複合体を形成する際には,その立体構造が変化することで電子伝達反応を制御していると考えられる.一般にはこのような高分子量の膜蛋白質であるCcOを含む蛋白質複合体の構造解析は困難であるが,^<15>NラベルしたCyt cを用いて3D-^1H-^<15>N NOESYHSQC(^<15>N-edited NOESY)を用いることで,CcO結合によるCytcの構造変化を検出することに成功した.特に,本研究者等のこれまでの研究から推定されたCyt cのCcOに対する相互作用部位周辺がCcOの結合に伴い有意な構造変化が観測され,Cyt cはCcOと電子伝達複合体を形成する際にはその相互作用部位付近に特異的な構造変化を起こすことが示唆された.今後さらに定量的な構造解析を進めることにより,構造変化による電子伝達の制御機構が明らかになると期待できる.
    2.ドッキングシミュレーションによるCcO側の会合部位の同定 東京大学の北尾准教授の研究グループと共同で,CcO-Cytc電子伝達複合体形成の際のCcO側の相互作用部位について検討を行った.剛体モデルを用いたドッキングシミュレーションの結果,Cyt c側の相互作用部位は本研究者らがNMRを用いて実験的に明らかにした部位と一致し,一方,CcO側も予想通り,負電荷と疎水性のアミノ酸残基による相互作用部位の形成が認められた.さらにここで得られた結果についてMDを適用することにより,さらに詳細にCcO)側の相互作用部位を明らかにすることで,CcO側からもCcO-Cytc間の電子伝達機構を解明できると期待できる.
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 20051002
  • 高圧分光法を用いた蛋白質における構造的揺らぎの解析
    科学研究費助成事業
    2007 - 2007
    石森 浩一郎; 内田 毅; 竹内 浩
    蛋白質構造の構造的揺らぎを定量的に解明するため,人工的な分子内電子伝達蛋白質を設計し,その電子伝達速度の圧力依存性から算出した蛋白質構造における特定の2点問の線圧縮率と,多核多次元NMR法によるdistance geometryや緩和測定から得られる構造的揺らぎの結果を比較した.人工的な分子内電子伝達蛋白質であるルテニウム置換亜鉛ミオグロビン(48,81,83位にそれぞれRu錯体を修飾)の光励起によるZnからRu,あるいはその逆の電子移動過程の反応速度を,常圧から2000気圧程度までの圧力で追跡し,その圧力依存性から,その亜鉛ポルフィリンの亜鉛イオンと蛋白質表面に特異的に修飾したRu錯体間の距離は,Ru錯体の修飾位置(48,81,83位)によって,加圧により0.1から2Å程度,距離が短縮される場合(48位と伸張される場合(81,83位)が観測された.このような異方的な蛋白質構造の短縮・伸張は,緩和測定の結果から得られた局所的な運動性や,distance geometryとは相関がみられず,従来想定されていたように,アミノ酸残基の局部的な運動性や主鎖構造のずれが大きい部位で,必ずしも蛋白質構造の大きな揺らぎが起こっているのではないということを示すことができた.さらに,酸素結合蛋白質であるミオグロビンに比べ,外部からの配位子の結合がなく,そのヘム鉄が6配位構造であるシトクロムcについてもNMRによる緩和時間測定を行ない,主鎖構造の運動性について検討した.その結果,主鎖末端領域やループ領域にやや運動性の高い領域が観測されたものの,全体的にミオグロビンに比べ運動性が制限されている領域が多く,シトクロムcは,ミオグロビンに比べ,蛋白質構造上の揺らぎが小さいことを示唆している.
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 19029002
  • ヘム依存性転写制御複合体の構造と機能
    科学研究費助成事業
    2006 - 2007
    石森 浩一郎; 内田 毅
    ヘム依存性転写因子Irrにおける酸化修飾機構の詳細を検討するため,典型的なペプチド鎖の酸化修飾様式であるカルボニル化を認識する「Oxyblot」法を用いて検討したところ,過酸化水素のスカベンジャー試薬であるカタラーゼを添加した際に酸化修飾が大きく阻害されることを見出した.一方,OHラジカルやO_2-のスカベンジャー試薬の添加ではその阻害効果が見られなかったことから,Irrはヘムと分子状酸素の存在下で過酸化水素を産生し,この過酸化水素によってペプチド鎖の酸化修飾反応が引き起こされることが示された.さらに,以上のような過酸化水素の産生部位を同定するために,ヘムの軸配位子と想定されるCysやHisをそれぞれAlaに置換し,その酸化修飾反応を追跡したところ,His残基が連続しているHis117,His118,His119の置換により酸化修飾反応が大きく阻害されることが示された.しかし,この変異体において産生する過酸化水素の定量を行ったところ,野生型同様の産生能を示し,過酸化水素は酸化修飾には必須であるものの,ペプチド鎖への酸化修飾反応の直接的な活性種ではないことが示唆された.づまり,Irrによって産生された過酸化水素は,再びHis117,His118,His119付近の酸化活性化部位によって,さらに活性な酸化活性種に変換されることを示唆している.以上の結果からIrrにおける酸化修飾反応は,分子状酸素から過酸化水素を経た二段階の活性化反応で進行し,そこで生成した酸化活性種が蛋白質分解の端緒となることが考えられる.
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 18054002
  • 圧力を用いた分子体積プロファイル解析による蛋白質立体構造形成過程での水分子の寄与
    科学研究費助成事業
    2006 - 2007
    石森 浩一郎; 内田 毅
    本年度の研究実績の概要は以下のとおりである。
    1.疎水性アミノ酸残基からの脱水和の分子体積に対する寄与: 疎水性部位からの脱水和による部分分子体積減少の実験的確証を得るため、Cyt cの蛋白質表面に位置する親水性のAsp93を疎水性のLeuに置換し、この変異による立体構造形成に伴う体積変化を追跡した。その結果、この変異により、その立体構造形成による体積の減少量は、約5mLmol^<-1>程度増加した。
    2.高圧下時分割蛍光観測システムの構築疎水性アミノ酸残基からの脱水和の分子体積に対する寄与: 蛋白質の立体構造形成機構を考える上で重要な遷移状態における水分子の挙動を解明するためには、活性化体積ΔV^≠を見積もる必要がある。従来、Cyt cでは、このΔV^≠を見積もるため、種々の圧力下におけるヘムの紫外可視吸収を利用してきたが、この手法では蛋白質部分の構造変化が直接には反映されない。そこで、立体構造形成により、ヘムに近接することでその蛍光強度が減少するTrpの蛍光に注目し、蛋白質部分の変化を直接観察することを試みた。高圧下での立体構造形成反応の追跡については、還元型CytcのCO結合体が非結合体に比べその安定性が低く、レーザー光照射によるヘム鉄からCO分子の解離より、立体構造形成反応が開始可能であることを利用した。その結果、高濃度の塩酸グアニジン存在下のCO結合還元型Cyt cや、COが結合しない酸化型Cyt cでは光照射により、有意な蛍光変化は観測されないが、3.6M塩酸グアニジン存在下のCO結合還元型型Cyt cでは光照射に伴い、蛍光強度の低下が観測された。これはCOの解離によって立体構造形成反応が進行したと考えられ、本装置を用いて種々の圧力下における蛋白質立体構造形成反応をその蛍光変化により、追跡できることが示された。現状では観測される蛍光の強度が弱いが、集光レンズの装着などにより、その強度を上げることで、再現性の良い定量的な測定が期待できる。
    日本学術振興会, 特定領域研究, 北海道大学, 18031001
  • シトクロムcの翻訳後修飾を行うタンパク質システムの作用機構の解明
    科学研究費補助金(若手研究(B))
    2006 - 2007
    内田 毅
    本研究は、シトクロムcという原核生物から真核生物までほぼすべての生物が有するタンパク質の成熟化を行うタンパク質群であるCcm(Cytochrome c maturation)の作用機構を明らかにすることを目的としている。シトクロムcはミトコンドリアの呼吸鎖における電子伝達タンパク質と機能する他、細胞死であるアポトーシスの引き金となるタンパク質であることから、生成及びその品質管理を理解することは重要であると共に、CcmはC型ヘムを有するタンパク質を大腸菌や無細胞系で発現させる時には必須である、その効率の点で未解明な部分が多く、Ccmの理解はタンパク質工学的にも重要な課題の一つである。本研究の共同研究者であるOxford大学のFerguson教授らの研究により、8個存在するCcmタンパク質の中でもCcmEがヘムをシトクロムcに引き渡し、チオエーテル結合の形成という翻訳後修飾を行うことが生化学的に報告されていた。我々はこの機構を詳細に検討することを試みた。Ferguson教授らは細菌(Hydrogenobacter thermophilus)由来のシトクロムcを用いていたが、今回、ホ乳類であるウマ、及び酵母であるSaccharomyces cerevisiae由来のシトクロムcを用い、翻訳後修飾過程を検討したが、翻訳後修飾は形成されなかった。これは、CcmEによるシトクロムcの選択性を表している。CcmEとこれらのシトクロムcの相互作用を表面プラズモン共鳴装置により解析したが、全く相互作用しなかった。以上のことから、CcmEはシトクロムcのある特定の部位を認識し、ヘムの受け渡しを行っていることがわかった。今後はH. thermophilus由来のシトクロムcの認識部位を明らかにすることを試みる。それにより、CcmEを利用したより広汎なC型ヘムをもつタンパク質の翻訳後修飾につながり、外来タンパク質の発現における有用な情報が得られると期待される。
    文部科学省, 若手研究(B), 北海道大学, Principal investigator, Competitive research funding, 18770102
  • Development of Detection Methods of Dynamical Higher Order Structures of Proteins and Its Application to Elucidation of Structure-Function Relations of Proteins.
    Grants-in-Aid for Scientific Research
    2002 - 2006
    KITAGAWA Teizo; MIZUTANI Yasuhisa; UCHIDA Takeshi
    Structural biology became a main subject in biophysical chemistry after the human genome problem, and 'Protein 3000' project has been successfully carried out. This project intended to uncover the protein structures with x-ray crystallography and NMR spectroscopy. Thus, the static structures of many proteins have been solved, but dynamical structures remained to be revealed to understand how proteins perform their functions. Our research aimed to provide more detailed structures of active sites of large proteins and also dynamical structures in their functioning state. For this purpose vibrational spectroscopy was adopted. New systems for obtaining time-resolved visible and ultraviolet resonance Raman spectra and microscope FTIR spectra were developed and applied to the following eights subjects; 1) Detection of ultrafast structural change of chromophores by using picosecond time-resolved visible resonance Raman spectroscopy, 2) Detection of fast changes of higher order structures of proteins by using subnanosecond time-resolved ultraviolet resonance Raman spectroscopy, 3) Elucidation of the primary process in protein folding/unfolding by using laser temperature jump technique, 4) Development of a novel spectroscopy for functionally-important protein fluctuation, 5) Elucidation of the primary process in the light-induced DNA repair by DNA photolyases, 6) FTIR microspectroscopic investigation of amyloid fibril structures and a trigger mechanism along its formation, 7) Mechanism of sensing of environment and information transduction to a functional domain by gas sensor heme proteins, 8) Elucidation of mechanism of oxygen activation and proton active transport by heme enzymes. In practice we have constructed several inventive time-resolved resonance Raman systems, which cover a wide ranges of excitation wavelengths (from ultraviolet to near infrared) and time-resolution (from picosecond to second). We applied these systems successfully to basic proteins like hemoglobin and myoglobin and some new proteins like gas sensor proteins. We succeeded in elucidating mechanisms of target discrimination and information transmission in the gas sensor proteins.
    Japan Society for the Promotion of Science, Grant-in-Aid for Specially Promoted Research, 14001004
  • 時間分解紫外共鳴ラマン法によるセンサー蛋白の情報感知・伝達及び機能発現機構の解明
    科学研究費助成事業
    2002 - 2002
    北川 禎三; 内田 毅
    本研究の実施前に辞退する事になったため本格的な実施ではないが、特別推進研究においても関連課題を実施しているので成果の一部をここに記す。
    バシラスという細菌の酵素分子センサーであるHemATという蛋白の共鳴ラマンスペクトルを測定し、酸素分子の特異的認識メカニズムを構造化学的に調べた。すなわち、HemATの鉄-酸素伸縮振動を同位体置換法で帰属し、この振動数が非常に低い事から、鉄に結合した酸素がまわりの蛋白と強く水素結合していると結論した。シグナル伝達部の長さを変えると、強く水素結合した酸素とそうでない酸素の存在比が変化したので、その水素結合が情報伝達に寄与していると考えられた。
    日本学術振興会, 基盤研究(S), 岡崎国立共同研究機構, 14103003