博士（農学）, 東京大学大学院農学生命科学研究科

環境細菌

クオラムセンシング

アオコ

赤潮

魚醤

シデロフォア

海洋生物資源

海洋天然物

生物有機化学

異宿主生産

生合成遺伝子

メタゲノム

生理活性物質

ライフサイエンス, 水圏生命科学, 水圏天然物化学

ナノテク・材料, 生物分子化学

ライフサイエンス, 薬系化学、創薬科学

学士課程, 水産学部

修士課程, 水産科学院

博士課程, 水産科学院

Dopamine-Derived Guanidine Alkaloids from a Didemnidae Tunicate: Isolation, Synthesis, and Biological Activities.
Ryuichi Sakai; Ken Matsumura; Hajime Uchimasu; Kei Miyako; Tohru Taniguchi; V Raghavendra Rao Kovvuri; Anjana Delpe Acharige; Kenneth G Hull; Daniel Romo; Lakkana Thaveepornkul; Sarin Chimnaronk; Hiroko Miyamoto; Ayato Takada; Hiromi Watari; Masaki J Fujita; Jiro Sakaue
The Journal of organic chemistry, 2024年04月01日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Mellpaladines A-C (1-3) and dopargimine (4) are dopamine-derived guanidine alkaloids isolated from a specimen of Palauan Didemnidae tunicate as possible modulators of neuronal receptors. In this study, we isolated the dopargimine derivative 1-carboxydopargimine (5), three additional mellpaladines D-F (6-8), and serotodopalgimine (9), along with a dimer of serotonin, 5,5'-dihydroxy-4,4'-bistryptamine (10). The structures of these compounds were determined based on spectrometric and spectroscopic analyses. Compound 4 and its congeners dopargine (11), nordopargimine (15), and 2-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydroisoquinolin-1-yl)ethan-1-amine (16) were synthetically prepared for biological evaluations. The biological activities of all isolated compounds were evaluated in comparison with those of 1-4 using a mouse behavioral assay upon intracerebroventricular injection, revealing key functional groups in the dopargimines and mellpaladines for in vivo behavioral toxicity. Interestingly, these alkaloids also emerged during a screen of our marine natural product library aimed at identifying antiviral activities against dengue virus, SARS-CoV-2, and vesicular stomatitis Indiana virus (VSV) pseudotyped with Ebola virus glycoprotein (VSV-ZGP).

Function of the algicidal bacterium Pseudomonas sp. Go58 isolated from the biofilm on a water plant, and its active compounds, pyoluteorins
Shuhe Chen; Miyu Haga; Ichiro Imai; Ryuichi Sakai; Masaki J. Fujita
Science of The Total Environment, 872, 162088, 162088, Elsevier BV, 2023年05月
研究論文（学術雑誌）

Interaction of Polyamine-modified Marine Peptide Aculeine A with Cell Membranes: Disruption or Entry
Hiromi Watari; Reimi Kishi; Satoko Matsunaga; Takayuki Nishikawa; Yuji Sawada; Akito Honda; Masaki J Fujita; Ryuichi Sakai
Chemistry Letters, 52, 3, 185, 189, The Chemical Society of Japan, 2023年03月05日
研究論文（学術雑誌）

Diverse Aromatic Metabolites in the Solitary Tunicate Cnemidocarpa irene
Kei Miyako; Yoko Yasuno; Tetsuro Shinada; Masaki J. Fujita; Ryuichi Sakai
Journal of Natural Products, 83, 10, 3156, 3165, American Chemical Society (ACS), 2020年10月23日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Fourteen aromatic metabolites (6-19) were isolated from an aqueous extract of the solitary tunicate Cnemidocarpa irene collected in Hokkaido, Japan. The structures of the metabolites were determined based on the spectroscopic interpretations, including one- and two-dimensional NMR, mass spectra, UV, and circular dichroism data. The biopterin analogue 10 modulated the behavior of mice after intracerebroventricular injection and showed a weak affinity to ionotropic glutamate receptor subtypes. Analyses of fluorescent coelomic fluid of the tunicate revealed that pterin 12 was responsible for the fluorescence of the blood cells, while β-carbolines 1 and 3 were fluorescent compounds in the serum. The metabolic profiles in adults, juveniles, larvae, and eggs of the animal differed substantially, suggesting that the metabolism of the animal, especially biosynthesis of aromatic secondary metabolites, changes over different life stages.

Questiomycins, Algicidal Compounds Produced by the Marine Bacterium Alteromonas sp. D and Their Production Cue.
Saki Umetsu; Mamoru Kanda; Ichiro Imai; Ryuichi Sakai; Masaki J Fujita
Molecules (Basel, Switzerland), 24, 24, 2019年12月10日, ［査読有り］, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, Questiomycin A (1) along with three new compounds, questiomycins C-E (2-4), were isolated from culture of Alteromonas sp. D, an algicidal marine bacterium, guided by algal lethality assay using the raphidophyte, Chattonella antiqua, one of the causative organisms of harmful algal bloom. The structures of 1-4 were assigned on the basis of their spectrometric and spectroscopic data. Compounds 1 to 4 exhibited algicidal activity against C. antiqua with LC50 values ranging from 0.18 to 6.37 M. Co-cultivation experiment revealed that 1 was produced only when the microalgae and the bacterium are in close contact, suggesting that some interactions between them trigger the biosynthesis of questiomycins. These results suggested that the algicidal bacteria such as Alteromonas sp. D can control microalgae chemically in marine ecosystem.

Structure and reactivity of a siderophore-interacting protein from the marine bacterium Shewanella reveals unanticipated functional versatility
Inês B. Trindade; José M. Silva; Bruno M. Fonseca; Teresa Catarino; Masaki Fujita; Pedro M. Matias; Elin Moe; Ricardo O. Louro
Journal of Biological Chemistry, 294, 1, 157, 167, Elsevier BV, 2019年01月
研究論文（学術雑誌）

Elemental composition and ultrafine structure of the skeleton in shell-bearing protists—A case study of phaeodarians and radiolarians
Yasuhide Nakamura; Izumi Iwata; Rie S. Hori; Naomi Uchiyama; Akihiro Tuji; Masaki J. Fujita; Daiske Honda; Hiroaki Ohfuji
Journal of Structural Biology, 204, 1, 45, 51, 2018年10月
英語, 研究論文（学術雑誌）

Cloning of the Bisucaberin B Biosynthetic Gene Cluster from the Marine Bacterium Tenacibaculum mesophilum, and Heterologous Production of Bisucaberin B
Masaki Fujita; Yusuke Goto; Ryuichi Sakai
Marine Drugs, 16, 9, 342, 342, MDPI AG, 2018年09月19日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, The biosynthetic gene cluster for bisucaberin B (1, bsb gene cluster), an N-hydroxy-N-succinyl diamine (HSD)-based siderophore, was cloned from the marine bacterium Tenacibaculum mesophilum, originated from a marine sponge. The bsb gene cluster consists of six open reading frames (ORFs), in contrast to the four ORFs typically seen in biosynthetic gene clusters of the related molecules. Heterologous expression of the key enzyme, BsbD2, which is responsible for the final biosynthetic step of 1 resulted in production of bisucaberin B (1), but not bisucaberin (2) a macrocyclic counterpart of 1. To date, numbers of related enzymes producing macrocyclic analogues have been reported, but this work represents the first example of the HSD-based siderophore biosynthetic enzyme which exclusively produces a linear molecule rather than macrocyclic counterparts.

KB343; a Cyclic Tris-guanidine Alkaloid from Palauan Zoantharian Epizoanthus illoricatus
Ken Matsumura; Tohru Taniguchi; James D. Reimer; Shuntaro Noguchi; Masaki J. Fujita; Ryuichi Sakai
Org. Lett., 20, 3039, 3043, 2018年05月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Two New Mycosporine-like Amino Acids LC-343 and Mycosporine-ethanolamine from the Micronesian Marine Sponge Lendenfeldia chondrodes
Yuta Oda; Quang Zhang; Satoko Matsunaga; Masaki J. Fujita; Ryuichi Sakai
CHEMISTRY LETTERS, 46, 8, 1272, 1274, 2017年08月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

A novel small compound HPH-15 antagonizes TGF-beta/Smad signaling and ameliorates experimental skin fibrosis
V. H. Luong; T. Chino; A. Tokuriki; N. Oyama; Y. Sasaki; D. Ogura; S. Niwa; M. Fujita; Y. Okamoto; M. Otsuka; H. Ihn; M. Hasegawa
JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, 137, 5, S46, S46, 2017年05月
英語

N-Methyl-β-carbolinium Salts and an N-Methylated 8-Oxoisoguanine as Acetylcholinesterase Inhibitors from a Solitary Ascidian, Cnemidocarpa irene.
Yohei Tadokoro; Teruaki Nishikawa; Taichi Ichimori; Satoko Matsunaga; Masaki J. Fujita; Ryuichi Sakai
ACS Omega, 2, 3, 1074, 1080, 2017年02月, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Mellpaladines and dopargimine, novel neuroactive guanidine alkaloids from a Palauan Didemnidae tunicate
Hajime Uchimasu; Ken Matsumura; Masashi Tsuda; Keiko Kumagai; Mai Akakabe; Masaki J. Fujita; Ryuichi Sakai
TETRAHEDRON, 72, 45, 7185, 7193, 2016年11月
英語, 研究論文（学術雑誌）

Production of Avaroferrin and Putrebactin by Heterologous Expression of a Deep-Sea Metagenomic DNA
Masaki Fujita; Ryuichi Sakai
Marine Drugs, 12, 9, 4799, 4809, MDPI AG, 2014年09月12日
研究論文（学術雑誌）

Protoaculeine B, a Putative N-Terminal Residue for the Novel Peptide Toxin Aculeines
Satoko Matsunaga; Reimi Kishi; Kazunori Otsuka; Masaki J Fujita; Masato Oikawa; Ryuichi Sakai
Organic Letters, 16, 11, 3090, 3093, American Chemical Society (ACS), 2014年06月06日
研究論文（学術雑誌）

Bisucaberin B, a Linear Hydroxamate Class Siderophore from the Marine Bacterium Tenacibaculum mesophilum
Fujita Masaki J.; Nakano Koji; Sakai Ryuichi
Molecules, 18, 4, 3917, 3926, MDPI, 2013年04月02日
英語, 研究論文（学術雑誌）, A siderophore, named bisucaberin B, was isolated from Tenacibaculum mesophilum bacteria separated from a marine sponge collected in the Republic of Palau. Using spectroscopic and chemical methods, the structure of bisucaberin B (1) was clearly determined to be a linear dimeric hydroxamate class siderophore. Although compound 1 is an open form of the known macrocyclic dimer bisucaberin (2), and was previously described as a bacterial degradation product of desferrioxamine B (4), the present report is the first description of the de novo biosynthesis of 1. To the best of our knowledge, compound 1 is the first chemically characterized siderophore isolated from a bacterium belonging to the phylum Bacteroidetes.

Heterologous production of desferrioxamines with a fusion biosynthetic gene cluster
Masaki J. Fujita; Ryuichi Sakai
Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 77, 12, 2467, 2472, 12, 2013年, ［査読有り］
英語, 研究論文（学術雑誌）

Phylogenetically Novel LuxI/LuxR-Type Quorum Sensing Systems Isolated Using a Metagenomic Approach
Eri Nasuno; Nobutada Kimura; Masaki J. Fujita; Cindy H. Nakatsu; Yoichi Kamagata; Satoshi Hanada
Applied and Environmental Microbiology, 78, 22, 8067, 8074, American Society for Microbiology, 2012年11月15日, ［国際誌］
英語, 研究論文（学術雑誌）, A great deal of research has been done to understand bacterial cell-to-cell signaling systems, but there is still a large gap in our current knowledge because the majority of microorganisms in natural environments do not have cultivated representatives. Metagenomics is one approach to identify novel quorum sensing (QS) systems from uncultured bacteria in environmental samples. In this study, fosmid metagenomic libraries were constructed from a forest soil and an activated sludge from a coke plant, and the target genes were detected using a green fluorescent protein (GFP)-basedEscherichia colibiosensor strain whose fluorescence was screened by spectrophotometry. DNA sequence analysis revealed two pairs of new LuxI familyN-acyl-l-homoserine lactone (AHL) synthases and LuxR family transcriptional regulators (clones N16 and N52, designated AubI/AubR and AusI/AusR, respectively). AubI and AusI each produced an identical AHL,N-dodecanoyl-l-homoserine lactone (C₁₂-HSL), as determined by nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry. Phylogenetic analysis based on amino acid sequences suggested that AusI/AusR was from an uncultured member of theBetaproteobacteriaand AubI/AubR was very deeply branched from previously described LuxI/LuxR homologues in isolates of theProteobacteria. The phylogenetic position of AubI/AubR indicates that they represent a QS system not acquired recently from theProteobacteriaby horizontal gene transfer but share a more ancient ancestry. We demonstrated that metagenomic screening is useful to provide further insight into the phylogenetic diversity of bacterial QS systems by describing two new LuxI/LuxR-type QS systems from uncultured bacteria.

The Bioassay-Guided Isolation of Growth Inhibitors of Adult T-Cell Leukemia (ATL), from the Jamaican Plant Hyptis verticillata, and NMR Characterization of Hyptoside
Toshiyuki Hamada; Yohann White; Mitsuyoshi Nakashima; Yusuke Oiso; Masaki J. Fujita; Hiroaki Okamura; Tetsuo Iwagawa; Naomichi Arima
Molecules, 17, 8, 9931, 9938, MDPI AG, 2012年08月17日
研究論文（学術雑誌）

Heterologous production of bisucaberin using a biosynthetic gene cluster cloned from a deep sea metagenome
Masaki J. Fujita; Nobutada Kimura; Hisayoshi Yokose; Masami Otsuka
Mol. BioSyst., 8, 2, 482, 485, Royal Society of Chemistry (RSC), 2012年
研究論文（学術雑誌）

Cloning and Heterologous Expression of the Vibrioferrin Biosynthetic Gene Cluster from a Marine Metagenomic Library
FUJITA Masaki J.; KIMURA Nobutada; SAKAI Atsushi; ICHIKAWA Yoichi; HANYU Tomohiro; OTSUKA Masami
Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 75, 12, 2283, 2287, Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, 2011年12月23日
英語, 研究論文（学術雑誌）, A biosynthetic gene cluster of siderophore consisting of five open reading frames (ORFs) was cloned by functional screening of a metagenomic library constructed from tidal-flat sediment. Expression of the cloned biosynthetic genes in Escherichia coli led to the production of vibrioferrin, a siderophore originally reported for the marine bacterium Vibrio parahaemolyticus. To the best of our knowledge, this is the first example of heterologous production of a siderophore by biosynthetic genes cloned from a metagenomic library. The cloned cluster was one of the largest of the clusters obtained by functional screening. In this study, we demonstrated and extended the possibility of function-based metagenomic research.

Actin-Aggregating Cucurbitacins from Physocarpus capitatus
Katherine N. Maloney; Masaki Fujita; Ulrike S. Eggert; Frank C. Schroeder; Christine M. Field; Timothy J. Mitchison; Jon Clardy
Journal of Natural Products, 71, 11, 1927, 1929, American Chemical Society (ACS), 2008年12月01日
研究論文（学術雑誌）

Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans
Rebecca A Butcher; Masaki Fujita; Frank C Schroeder; Jon Clardy
Nature Chemical Biology, 3, 7, 420, 422, Springer Science and Business Media LLC, 2007年07月
研究論文（学術雑誌）

Tyrosol is a quorum-sensing molecule in Candida albicans
CHEN H
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 14, 5048, 5052, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2004年04月06日
研究論文（学術雑誌）

Ageladine A: An Antiangiogenic Matrixmetalloproteinase Inhibitor from the Marine Sponge Agelas nakamurai
Masaki Fujita; Yoichi Nakao; Shigeki Matsunaga; Motoharu Seiki; Yoshifumi Itoh; Jun Yamashita; Rob W. M. van Soest; Nobuhiro Fusetani
Journal of the American Chemical Society, 125, 51, 15700, 15701, American Chemical Society (ACS), 2003年12月01日
研究論文（学術雑誌）

Callysponginol Sulfate A, an MT1-MMP Inhibitor Isolated from the Marine Sponge Callyspongia truncata
Masaki Fujita; Yoichi Nakao; Shigeki Matsunaga; Rob W. M. van Soest; Yoshifumi Itoh; Motoharu Seiki; Nobuhiro Fusetani
Journal of Natural Products, 66, 4, 569, 571, American Chemical Society (ACS), 2003年04月01日
研究論文（学術雑誌）

Sodium 1-(12-Hydroxy)octadecanyl Sulfate, an MMP2 Inhibitor, Isolated from a Tunicate of the Family Polyclinidae
Masaki Fujita; Yoichi Nakao; Shigeki Matsunaga; Teruaki Nishikawa; Nobuhiro Fusetani
Journal of Natural Products, 65, 12, 1936, 1938, American Chemical Society (ACS), 2002年12月01日
研究論文（学術雑誌）

Isolation and structure elucidation of two phosphorylated sterol sulfates, MT1-MMP inhibitors from a marine sponge Cribrochalina sp.: revision of the structures of haplosamates A and B
Masaki Fujita; Yoichi Nakao; Shigeki Matsunaga; Motoharu Seiki; Yoshifumi Itoh; Rob W.M van Soest; Markus Heubes; D.John Faulkner; Nobuhiro Fusetani
Tetrahedron, 57, 18, 3885, 3890, Elsevier BV, 2001年04月
研究論文（学術雑誌）

Ancorinosides B–D, inhibitors of membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), from the marine sponge Penares sollasi Thiele
Masaki Fujita; Yoichi Nakao; Shigeki Matsunaga; Motoharu Seiki; Yoshifumi Itoh; Rob W.M van Soest; Nobuhiro Fusetani
Tetrahedron, 57, 7, 1229, 1234, Elsevier BV, 2001年02月
研究論文（学術雑誌）

Isolation and Structure Elucidation of Vicenistatin M, and Importance of the Vicenisamine Aminosugar for Exerting Cytotoxicity of Vicenistatin.
MATSUSHIMA YOSHITAKA; NAKAYAMA TAKUYA; FUJITA MASAKI; BHANDARI RENUKA; EGUCHI TADASHI; SHINDO KAZUTOSHI; KAKINUMA KATSUMI
The Journal of Antibiotics, 54, 3, 211, 219, JAPAN ANTIBIOTICS RESEARCH ASSOCIATION, 2001年
英語, 研究論文（学術雑誌）, A new analogue of Vicenistatin was isolated from the producing strain Streptomyces sp. HC-34. A characteristic of the elucidated structure involved the existence of a neutral sugar mycarose instead of an aminosugar vicenisamine of Vicenistatin. The absolute stereochemistry of the new analogue (named as Vicenistatin M) was determined by the synthesis of D-mycarose and of vicenistatin M itself. Biological testing of Vicenistatin M suggested the importance of vicenisamine for exerting the cytotoxicity of vicenistatin.

Biosynthetic pathway of macrolactam polyketide glycoside antitumor antibiotic vicenistatins
OTSUKA M.
Tetrahedron, 56, 42, 8281, 8286, Elsevier BV, 2000年10月
研究論文（学術雑誌）

Miraziridine A, a Novel Cysteine Protease Inhibitor from the Marine Sponge Theonella aff. mirabilis1
Yoichi Nakao; Masaki Fujita; Kaoru Warabi; Shigeki Matsunaga; Nobuhiro Fusetani
Journal of the American Chemical Society, 122, 42, 10462, 10463, American Chemical Society (ACS), 2000年10月01日
研究論文（学術雑誌）

Tokaramide A,a new cathepsin B inhibitor from the marine sponge Theonella aff. mirabilis
Nobuhiro Fusetani; Masaki Fujita; Yoichi Nakao; Shigeki Matsunaga; Rob W.M. van Soest
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9, 24, 3397, 3402, Elsevier BV, 1999年12月
研究論文（学術雑誌）

メタゲノム由来新規オートインデューサー様物質の生理活性
新村樹; 三輪俊太; 酒井隆一; 藤田雅紀; 木村信忠, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021年

メタゲノム由来新規オートインデューサー様物質の生産と同定
伊藤秀輝; 酒井隆一; 藤田雅紀; 木村信忠, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021年

Pseudomonas属アオコ殺藻細菌および活性物質の野生藻類に対する影響
陳樹河; 酒井隆一; 藤田雅紀; 今井一郎, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021年

メタボロミクスを用いた藻類と殺藻細菌の共培養系における活性物質の探索
羽賀美優; 今井一朗; 酒井隆一; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集(CD-ROM), 2021, 2021年

海綿-シアノバクテリア共生系由来新規糖代謝物の単離・構造解析
野口祐輔; 小田悠太; 張権; 藤田雅紀; 酒井隆一, 日本水産学会北海道支部大会講演要旨集, 2020 (CD-ROM), 2020年

Alteromonas属殺藻細菌由来シデロフォアの同定と機能解析
神手大輝; 酒井隆一; 藤田雅紀; 今井一郎, 日本水産学会大会講演要旨集, 2019, 2019年

カイメン（海綿）に共生する製薬工場
生物工学, 96, 10, 593, 593, 2018年10月, ［招待有り］, ［筆頭著者, 責任著者］

Alteromonas属由来の殺藻物質の生産と殺藻様式に関する研究
梅津早希; 今井一郎; 酒井隆一; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集, 2017, 102, 2017年03月26日
日本語

アオコ原因種Microcystis aeruginosaに対する殺藻細菌の殺藻機構におけるクオラムセンシング関与の可能性
大洞裕貴; 宮下洋平; 小林淳希; 小峯佳奈子; 藤田雅紀; 酒井隆一; 織田さやか; 田中邦明; 今井一郎, 日本陸水学会大会講演要旨集, 82nd (Web), 2017年

カリブ海産ホヤTrididemnum solidumに含まれる抗腫瘍性化合物didemnin類の産生について
市森大地; 藤田雅紀; 今田千秋; 酒井隆一, 日本水産学会大会講演要旨集, 2016, 116, 2016年03月26日
日本語

Alteromonas属海洋細菌由来の赤潮殺藻物質
梅津早希; 今井一郎; 酒井隆一; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集, 2016, 113, 2016年03月26日
日本語

西表島産Spongosorites属海綿に含まれるタンパク質毒素の分離
酒井隆一; 中野宏治; 上田拓也; 北野雅也; 小野巧; 棚野豪太; 神保充; 藤田雅紀, 日本水産学会大会講演要旨集, 2016, 2016年

Alteromonas属海洋細菌由来の赤潮藻類殺藻物質
梅津 早希; 今井 一郎; 酒井 隆一; 藤田 雅紀, 天然有機化合物討論会講演要旨集, 58, 0, Poster32, 2016年

植物プランクトンの異常増殖によって引き起こされる赤潮は、養殖魚の大量斃死や二枚貝の毒化等により水産業に甚大な被害をもたらす。一方、海洋環境中には赤潮原因藻類を殺滅する活性を有する殺藻細菌の存在が知られており、また赤潮の消長と殺藻細菌の分布には相関が見られることから、殺藻細菌が実際に環境中で赤潮発生の抑止力となっていると推測されている。それら殺藻細菌の利用は赤潮の生物学的防除策として注目されているが、そのメカニズムについては未解明な点が多く、効率的な防除策の開発にはより多くの知見が必要である。

そこで、赤潮発生域である広島湾海水から分離され、珪藻・渦鞭毛藻・ラフィド藻等の多様な赤潮原因藻類に対し殺滅活性を示すAlteromonas属細菌DおよびK株¹（図１）を対象とし、赤潮殺滅機構、海洋環境中での赤潮抑制機能、および効果的な化学・生物学的防除法の開発を目標に、殺藻物質の同定と機能解析を試みた。

1. 殺藻物質の精製と構造決定

海洋細菌Alteromonas属D株を海水ベースの培地で培養後、培養上清に殺藻活性を確認した。活性物質を固相抽出し、各種クロマトグラフィーにより活性を指標に分画を進め、最終的に逆相HPLCにより440 nmに特徴的な吸収極大を示す化合物1を主要活性物質として得た。また、同様のUVスペクトルを示す3つのマイナー成分（化合物2-4）も合わせて精製した。

高分解能質量分析 (HRMS) およびNMR解析から、化合物1の分子式をC12H8N2O2と決定し、さらにNMRスペクトルを文献値と比較し、化合物1を既知のフェノキサゾン誘導体である2-aminophenoxazin-3-one（APO）と同定した（図２）²。これはコムギやライムギ等の陸上高等植物が生産するアレロパシー物質としての報告があり³、またHalomonas属などの細菌から抗微生物剤としても報告されている⁴。

図２．Alteromonas属由来殺藻物質APO (1) および新規誘導体2-4。

化合物2の分子式はC12H7N2O2Brと決定され、化合物１の臭素置換体と考えられた。APO (1)とプロトンNMRスペクトルを比較したところ、化合物１の6.3-6.4ppmの二つのシングレットピークが化合物2では一つになっていることから1位もしくは4位がBrに置換されていると推測された。また、HMBCスペクトルにおいて6.4ppmの¹Hから2位 (149.5 ppm) および12位 (145.6 ppm) に相関が見られたことから、1位が臭素化された構造と決定した（図２）。

HRMSおよび一次元NMR測定の結果から化合物3および4の分子式はそれぞれC13H10N2O3SおよびC13H10N2O2Sと決定された。NMRスペクトル解析により、化合物2同様に1位が置換されており、さらに両化合物で新たなメチルシグナルが観測された。また、メチル基水素から1位の炭素へのHMBC相関が確認されたことから、これらの構造を化合物1のメチルスルホキシド体およびメチルスルフィド体と決定した(図２)。化合物2-4はいずれも新規化合物であった。

２. 生物活性

化合物1および2について、赤潮原因藻類の一種であるラフィド藻Chattonella antiquaに対する生育阻害活性を評価した。C. antiquaを試験管中で培養し、培養開始1日目に化合物1を各濃度で

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, 天然有機化合物討論会実行委員会, 日本語

海綿・ホヤに共生する藍藻のケミカルバイオロジー
酒井隆一; 市森大地; 小田悠太; 藤田雅紀; 今田千秋, マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集, 17th, 51, 2015年05月30日
日本語

パラオ産Didemnidae科ホヤ由来新規神経活性化合物群Mellpaladine類に関する研究
内升 肇; 松村 賢; 津田 正史; 熊谷 慶子; 赤壁 麻依; 藤田 雅紀; 酒井 隆一, 天然有機化合物討論会講演要旨集, 57, 0, PosterP31, 2015年

神経には多様なイオンチャンネル型受容体、代謝調節型受容体、そしてイオンチャンネルが存在し、神経伝達や恒常性の維持を担っている。脳をはじめとした中枢神経はこれらが集中する器官であるといえる。我々は、海洋生物の抽出物をマウスの脳室内に投与し行動変化を観察することで、受容体・イオンチャネルに作用する化合物を探索してきた。海綿・ホヤを中心とした501種の水抽出物のスクリーニングを行った結果、パラオ産Didemnidae科ホヤにマウスの自発行動を抑制する活性を見出した。そこでこの活性を指標に精製を進めたところ、新規ジヒドロイソキノリンアルカロイドであるオピオイド受容体アゴニストdopargimine（1）およびセロトニン受容体アンタゴニストmellpaladine（Mell）A-F（2-7）、既知化合物4-guanidino butyric acid（8）を得た（Fig. 1）。さらに、複数の硫黄原子が付加したドーパミン様構造を持つ既知化合物群であるlissoclibadin類（9）も多数確認した。本発表では、これらの単離・構造決定および生理活性、推定生合成経路について報告する。

【Mellpaladine類及びDopargimineの単離】パラオ共和国で採取したDidemnidae科ホヤ（Pal 300）の冷凍保存試料を水で抽出し、抽出物を透析、低分子・高分子画分を得た。低分子画分にマウスに対する活性が認められたため、ゲルろ過カラム（Sephadex LH-20，H₂O-0.05 %TFA，MeOH-0.05%TFA）、逆相カラム（Wako C18，H₂O-0.05 %TFA，MeOH-0.05 %TFA）に供したのち、逆相HPLCで精製したところ、活性成分としてMell A-F（2-7）を得た。またMell類以外の新規活性成分としてdopargimine（1）を得た。また分離の過程で4-guanidino butyric acid（8）を得た。

【Dopargimine（1）の構造決定】Dopargimine（1）の分子式はHR-ESI-MSおよび¹³C-NMRスペクトルによりC₁₃H₁₈N₄O₂と推定した。¹H-NMRスペクトルの解析により2つのシングレット芳香族プロトン、１つのヘテロ原子に結合したプロトンなどを含む13個のプロトンが観測された。¹³C-NMRスペクトルでは8個のsp²炭素と5個のsp³炭素が観測された。HMBCスペクトルにおいて芳香族プロトンd 6.80（H-5）からd 116.1（C-8a）、d 145.7（C-7）、d 155.3（C-6）に、またd 7.44（H-8）からd132.8（C-4a）、d 145.7（C-7）、d155.3（C-6）に相関が観測されたこと、酸素原子が置換したと考えられる炭素がd 145.7（C-7）とd155.3（C-6）に観測されたことから2置換カテコール構造を持つと推定した。これはTLC上、１がFeCl₃で呈色されたことからも支持された。さらに、COSY、HMBCスペクトルの解析の結果、3，4-ジヒドロイソキノリン骨格が構築されていると推定した。側鎖の構造はCOSYおよびHMBCスペクトルより3つの連続したメチレンCH₂-9~11およびNH-12のイミンC-1のスピン系が推定された。また、1は坂口反応で赤色に呈色すること、およびアセチルアセトンと反応することでピリミジン誘導体1aを与えたことからC-13（d 157.6）はグアニジン基であると同定した。さらに1をNaBH₄で還元したところジヒドロ体1b（C₁₃H₂₀N₄O₂）が生成し、C-1（d176.5）がd 53.1にシフトしたことよりイミンの存在を確認した。ジヒドロ体1bのNMRデータ

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, 天然有機化合物討論会実行委員会, 日本語

海洋メタゲノムからの未知シデロフォア生合成遺伝子のクローニングと異宿主生産
藤田雅紀; 時田学幸; 石川高史; 酒井隆一, 日本水産学会大会講演要旨集, 2014, 121, 2014年03月27日
日本語

海綿メタゲノムからのアグロバクチン生合成遺伝子クラスターの取得と異宿主発現
藤田 雅紀; 時田 学幸; 石川 高史; 酒井 隆一, 天然有機化合物討論会講演要旨集, 56, 0, Poster55, 2014年

シデロフォアは微生物が産生する鉄の獲得に関与する化合物群であり、生物利用可能な鉄が不足する環境中において、多くの微生物が多様なシデロフォアを産生する。分離培養が困難な環境微生物の中には、他種微生物が産生した外因性のシデロフォアを自身の成育に必須とするものが報告されている。¹また、シデロフォアは微生物の宿主への感染・共生等の成立にも関与し、²さらには競合菌の遊泳阻害活性を持つものなども報告されている。³この様に、シデロフォアは微生物のケミカルコミュニケーションにおいて重要な働きを持つと考えられる。

一方、海洋無脊椎動物由来の多様な生理活性物質の多くは共生微生物が産生していると考えられているが、その多くは分離培養が困難である。それら難培養共生菌が利用するシデロフォアを明らかにすることができれば、共生菌の生態の理解、さらには培養可能化につながると期待される。そこで、微生物を分離培養することなく、直接全てのゲノムDNAを取得し解析するメタゲノム法を用いて、海洋無脊椎動物中におけるシデロフォア生合成遺伝子の解析と、その生産物の同定を試みた。

Figure 1. 主なカテコール型シデロフォアの構造。

１．海洋メタゲノムライブラリの構築とシデロフォアスクリーニング

日本沿岸各地で採集した海洋無脊椎動物を断片化後、バッファーあるいは海水中で組織を圧搾し滲出液を得た。遠心分離後、得られたペレットを溶菌バッファーで処理し、アルコール沈殿することで粗メタゲノムDNAを得た。その後、得られたDNAをフェノール/クロロホルム処理、CTAB処理等により精製し、アガロースゲル電気泳動により高分子量DNAを得た。その後、フォスミドベクターを用いクローニングする事で、平均インサートDNA長が約35 kbpで約50万クローンからなる海洋メタゲノムライブラリを構築した(Figure 2)。

作成したメタゲノムライブラリに対して、Chrome Azurol Sを用いたシデロフォア活性スクリーニングを行ったところ、⁴合計52個のシデロフォア生産クローンを見出した(Figure 2)。得られた活性クローンについて、そのシデロフォア生合成遺伝子クラスターの一部を解析したところ、カテコール型、ヒドロキサム酸型、カルボキシレート型など様々なタイプのシデロフォア生合成遺伝子に相同性を示したことから、本手法によって多様なシデロフォア生合成遺伝子の取得と生産が可能であることが示された。しかしながら、既知の生合成遺伝子クラスターと全く同じものは存在せず、実際の生産物の同定は断片的な配列情報からだけからでは困難であった。

Figure 2. 海洋無脊椎動物からのメタゲノムライブラリの構築とシデロフォアスクリーニングの概要。

２．海綿メタゲノム由来シデロフォア生合成遺伝子クラスターの解析

生産物の同定を目的に、生合成遺伝子全体の解析と化合物の生産研究を行った。熊本県天草産の未同定海綿メタゲノム由来の活性クローンについて全長配列35,554 bpを決定したところ、得られたDNA配列は海洋細菌であるVibrio furnissiiのものと90%程度で一

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, 天然有機化合物討論会実行委員会, 日本語

海洋細菌からの非環状ヒドロキサム酸型シデロフォアの単離と推定生合成遺伝子のクローニング
藤田雅紀; 中野宏治; 酒井隆一, 日本水産学会大会講演要旨集, 2013, 100, 2013年03月26日
日本語

パラオ産海綿由来細菌からのシデロフォアBisucaberin Bの単離および生合成遺伝子の取得と異宿主生産
藤田 雅紀; 中野 宏治; 酒井 隆一, 天然有機化合物討論会講演要旨集, 55, 0, PosterP, 56, 2013年

シデロフォアは微生物が産生する鉄キレート能を有する化合物群である。生物利用可能な鉄が不足している自然環境において、微生物はシデロフォアを用いて必須元素である鉄を獲得している。¹シデロフォアには医薬品として利用されるものもあり、また土壌や水質の改良剤としても期待されている。一方、微生物の中には他種の微生物が産生した外因性シデロフォアを自身の生育に必要とする種が数多く存在し、シデロフォアを介した微生物間の多様なコミュニケーションが存在する。²

本研究グループでは環境中から微生物遺伝資源を網羅的に取得するメタゲノム法を用いて、シデロフォア生合成遺伝子の探索と異宿主生産を試み、その結果N-hydroxy-N-succinyl cadaverine (HSC, 1) を構成単位とするシデロフォアの一つ、bisucaberin (2) の生合成遺伝子の取得と大腸菌での生産を報告している。³これまでにHSC型シデロフォアは複数知られており(Figure 1)、免疫抑制活性、マクロファージによるガン細胞溶解活性の増強等の様々な生物活性が報告されており、またそのいくつかは生合成遺伝子も取得されている。⁴しかしながら、生合成における縮合回数および大環状化の制御機構などは全く不明であり、その解明は酵素によるポリマーを含む望む多量体の構築、大環状化合物の生産を行うための基盤情報となる。

その様な中、パラオ産海綿由来細菌がこれまで微生物産物としては報告されていないHSC型シデロフォアを生産している事が示唆された。そこで、HSC型シデロフォアの構造多様化機構に関する知見を得ることを目的に活性物質の同定、およびその生合成遺伝子のクローニングを行ったので報告する。

Figure 1. N-hydroxy-N-succinyl cadaverine (1) と1を構成単位とするシデロフォア。

１：Bisucaberin Bの単離と構造決定

パラオ産海綿から分離した細菌に対して金属呈色試薬であるChrome Azurol Sを用い、シデロフォア生産活性を指標にスクリーニングを行ったところ、顕著な活性を示す株を見出した。得られた細菌の16S rRNA配列1444 bpを解析したところ、バクテロイデス門に属するTenacibaculum mesophilum NBRC16307 (accession number, AB681058) と完全に一致したため、同属同種であると判断した。

T. mesophilumを海水をベースとした培地で振とう培養後、シデロフォア活性を指標に培養上清の分画を進めたところ、単一の活性成分としてbisucaberin B (2, 38.9 mg/L) を得た。化合物2の¹Hおよび¹³C NMRスペクトルを解析したところ、多くのメチレンシグナルを確認し、またメチレン炭素以外はカルボニル炭素のみ存在する事から、本化合物はHSC (1) を構成単位としたシデロフォアである事が示唆された(Table 1)。Bisucaberin (3) やdesferrioxamine E (4) のような大環状HSC型シデロフォアは、対称構造から単量体様のスペクトルを示すのに対して、化合物2は二組のHCSシグナルが分離して観測された事から、非対象構造を有していると考えられた。また、高分解能ESIMSにより決定したその分子式は環状二量体である化合物3よりH₂O分大きい事から、本物質の構造を化合物3 のアミド結合が加水分解した非環状二量体であると推

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, 天然有機化合物討論会実行委員会, 日本語

線虫C. elegansの耐性幼虫フェロモン フェロモンで寿命が延びる！？モデル生物の化学生態学
藤田 雅紀, 化学と生物, 46, 7, 442, 443, 2008年07月, ［招待有り］, ［筆頭著者, 責任著者］
Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, 日本語

海をまるごとサイエンス : 水産科学の世界へようこそ
海に魅せられた北大の研究者たち, 第11章 海の遺伝子で薬を作る？
海文堂出版, 2018年08月, 9784303800017, 127p, 日本語

生体有機化学
橋本, 祐一; 村田, 道雄, 第1章 核酸
東京化学同人, 2012年10月, 9784807907656, x, 220p, 日本語

ミカーレ属海綿のマイカロライド生産菌は垂直伝播で獲得される
藤田雅紀; 高田健太郎
ゴードン会議 海洋天然物化学, 2018年03月08日, 英語, 口頭発表（招待・特別）
2018年03月04日 - 2018年03月09日, ［招待講演］

遺伝子から探す・作る海洋天然物
藤田雅紀
日本化学会北海道支部会講演会, 2016年10月14日
［招待講演］

アカデミックキャリアパス
藤田雅紀
第18回マリンバイオテクノロジー学会大会 若手シンポジウム, 2016年05月28日
［招待講演］

メタゲノム法を用いた海洋天然物化学研究
藤田雅紀
2015年度マリンケミカルバイオロジー研究会, 2015年03月27日
［招待講演］

メタゲノム法を用いた海洋天然物の異宿主生産
藤田雅紀
日本農芸化学会東北支部会第13回若手の会, 2012年10月05日

海洋天然物の異宿主生産を指向したメタゲノム研究
藤田雅紀
第5回札幌微生物生態学セミナー, 2012年08月03日
［招待講演］

異宿主発現法を用いた新規抗菌物質Pantocin Cの生産と同定
藤田雅紀
第3回万有若手シンポジウム, 2008年11月

生物資源化学特論Ⅱ, 2024年, 修士課程, 水産科学院

一般教育演習(ﾌﾚｯｼｭﾏﾝｾﾐﾅｰ), 2024年, 学士課程, 全学教育

健康と社会, 2024年, 学士課程, 全学教育

環境と人間, 2024年, 学士課程, 全学教育

機器分析化学, 2024年, 学士課程, 水産学部

潜水調査実習, 2024年, 学士課程, 水産学部

有機化学実験, 2024年, 学士課程, 水産学部

白身魚類の筋肉におけるカロテノイド蓄積能の向上・獲得に向けた萌芽的研究
科学研究費助成事業
2023年06月30日 - 2026年03月31日
平松 尚志; 東藤 孝; 藤田 雅紀
本研究では、魚類カロテノイド分解に関わる遺伝子候補に着目し、その翻訳制御機構を解明すると共に、同候補のゲノム編集が身色形質の改善に有効か否かを試すことを目的とする。目的達成に向け、「スカベンジャー受容体クラスBタイプ1（srb1）を介したアスタキサンチン（Ax）取込み量を増やし、βカロテンオキシゲナーゼ（bco）による分解を抑えることができれば、最終的に筋肉のAx蓄積量が増え赤色呈色性が強くなる」と仮説を立て、これを直接的にゲノム編集により実証する課題1と、未知な点が多いsrb1及びbcoの翻訳制御機構を明らかにする課題2を実施する。
R5年度は、公開ゲノムデータベースを探索し、ニジマスではbco1, bco1l, srb1遺伝子、メダカではbco1とbco1l遺伝子について、各ゲノム上の位置や配列を特定した。この情報を基に、課題1では、各遺伝子のガイドRNA（gRNA）を設計・合成した。これらのgRNAとCas9ヌクレアーゼを用いて、ニジマス及びメダカの受精卵に顕微注入し作出したF0胚について、ヘテロ二本鎖移動度分析（HMA）とシーケンス解析結果、両種ともにbco1lに関しては、変異導入個体が確認できた。一方で、その他の遺伝子については、変異導入個体の作出に至らなかった。課題2に関しては、両種から上記遺伝子転写産物のcDNAクローニングを行い、全てのクローニングを完了した。メダカbco1lについては、組換え蛋白質とその抗体を作製し、抗原組換え蛋白質との免疫陽性反応を得た。この抗体を用いて、消化管試料のウェスタンブロッティングを実施したが、陽性反応は確認できなかった。現在、bco1l以外の遺伝子由来の組換え蛋白質の作製も継続中である。一方、身色の赤色呈色を獲得前の若年魚と同呈色獲得後の出荷魚を用い、消化管におけるmiRNA発現データの取得を行った。
日本学術振興会, 挑戦的研究(萌芽), 北海道大学, 23K18041

メタゲノム由来新規インドール誘導体は細菌種を超えた普遍的なシグナル物質か？
科学研究費助成事業
2023年06月30日 - 2026年03月31日
藤田 雅紀
微生物は同種細胞密度を感知して様々な機能発現を制御するクオラムセンシング機構(QS)を有する。これまでQSは同種細胞にのみ機能し、異種間の相互作用は認識されていなかった。しかし、我々が見出した新規インドロキナゾリン化合物であるQAI-1は、本来の誘導物質（オートインデューサー、AI）が異なる複数のレポーターアッセイ系において、本来のAI以上のQS活性を示した。また、自身ではAIを生産せず、他者からAIを受容すると考えられるLux-soloと呼ばれる細菌が、環境中細菌の7割を占めると報告されている。そこでQAI-1が多くの菌種に対して普遍的に作用するのであれば、LuxR-soloを含め様々な細菌に対する汎用的な微生物機能誘導剤として利用できるのではと考え、その実現可能性を検討した。
①レポーターアッセイによる有効範囲の検討 それぞれC10-AHLとC6-AHLを本来の基質とするC. violaceun VIR24とS. marcescens AS-1に対してQAI-1を作用させたところ、10 pmolの処理でレポーター活性であるviolaceinの産生が認められた。一方でS. marcescens AS-1Δに関しては、約250 nmolのQAI-1添加によってもレポーター活性であるprodigiosinの産生が認められなかった。これまでレポーターアッセイを行った5株の中で、初めて活性を示さないものを見出した。
②遺伝子発現スクリーニング法の確立 環境から分離した野生菌株に対する機能発現試験を実施した。野生分離株はどの様な機能がQSで制御されているのかなど全く不明である。そこで、簡便に多検体を試験可能なシデロフォアと抗酸化物質および緑膿菌のQS表現型として知られるバイオフィルム産生試験を確立した。また、150検体を試験したところ73株に何らかの表現型変化が認められた。
日本学術振興会, 挑戦的研究(萌芽), 北海道大学, 23K18040

メタゲノムおよびメタボローム解析を用いた実環境での殺藻細菌の機能解明
科学研究費助成事業
2020年04月01日 - 2025年03月31日
藤田 雅紀; 二階堂 雅人; 木村 信忠
微生物は同種細胞密度を感知して様々な機能発現を制御するクオラムセンシング機構(QS)を有する。これまでQSは同種細胞にのみ機能し、異種間の相互作用は認識されていなかった。しかし、我々が見出した新規インドロキナゾリン化合物であるQAI-1は、本来の誘導物質（オートインデューサー、AI）が異なる複数のレポーターアッセイ系において、本来のAI以上のQS活性を示した。また、自身ではAIを生産せず、他者からAIを受容すると考えられるLux-soloと呼ばれる細菌が、環境中細菌の7割を占めると報告されている。そこでQAI-1が多くの菌種に対して普遍的に作用するのであれば、LuxR-soloを含め様々な細菌に対する汎用的な微生物機能誘導剤として利用できるのではと考え、その実現可能性を検討した。
① レポーターアッセイによる有効範囲の検討 それぞれC10-AHLとC6-AHLを本来の基質とするC. violaceun VIR24とS. marcescens AS-1に対してQAI-1を作用させたところ、10 pmolの処理でレポーター活性であるviolaceinの産生が認められた。一方でS. marcescens AS-1Δに関しては、約250 nmolのQAI-1添加によってもレポーター活性であるprodigiosinの産生が認められなかった。これまでレポーターアッセイを行った5株の中で、初めて活性を示さないものを見出した。
② 遺伝子発現スクリーニング法の確立 環境から分離した野生菌株に対する機能発現試験を実施した。野生分離株はどの様な機能がQSで制御されているのかなど全く不明である。そこで、簡便に多検体を試験可能なシデロフォアと抗酸化物質および緑膿菌のQS表現型として知られるバイオフィルム産生試験を確立した。また、78検体を試験したところ35株に何らかの表現型変化が認められた。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 23K20290

メタゲノムおよびメタボローム解析を用いた実環境での殺藻細菌の機能解明
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
2020年04月01日 - 2025年03月31日
藤田 雅紀; 木村 信忠; 二階堂 雅人
① 同定した殺藻細菌および殺藻物質の実環境での機能解析 Pseudomonas属殺藻細菌をモデルとし、アオコ原因藻類との共培養により産生誘導される殺藻物質を同定するためのメタボロミクス解析方法を確立した。解析の結果、共培養下で特異的に産生される化合物を見出し、赤潮原因藻類に対する殺藻物質として報告のあるpseudopyronine Aであり、またアオコ原因藻類である藍藻Microcystis aeruginosaに対しても顕著な活性を示した。以上の結果から、確立したメタボロミクス法は共培養で機能する殺藻物質を見出す手法として有望と考えられた。
② 赤潮・アオコ発生促進に関与する微生物の存在解析 Pseudomonas属殺藻細菌の機能解析の過程において緑藻および浮草などの光合成生物に対して増殖促進活性を示す植物ホルモン様化合物を見いだした。また、Pseudomonas属殺藻細菌の産物であるpyoluteorinを環境試水に作用したところ、緑藻Chlamydomonasが顕著に増加した。
③ 未分離未培養の殺藻細菌の検出とそれが生産する殺藻物質の同定 メタゲノム解析から水草バイオフィルムがPseudomonas属、Acidovorax属、Stenotrophomonas属、Rhizobium属などの培養可能な殺藻細菌の供給源である事が示された。また、殺藻細菌の割合はいずれも1－3％程度の存在率で十分な活性を示す事、未培養の殺藻細菌候補も存在する事が示唆された。
④ 分離殺藻細菌からの殺藻物質および生合成遺伝子の同定 環境試料から新たにRhizobium属、Stenotrophomonas属、Hydrogenophaga属を主とする殺藻細菌を得て、その培養液に殺藻活性を検出している。そのうちの一つであるRhizobium属細菌の培養液から、殺藻活性を示す炭化水素の結晶を得た。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 20H03070

メタゲノム情報からの難培養菌が要求する因子の特定と利用による培養可能化
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
2018年06月29日 - 2021年03月31日
藤田 雅紀
共生様式の解明 ミカーレ属海綿から得た細菌懸濁液に対して抗腫瘍抗生物質マイカロライド類の生合成遺伝子配列をターゲットとしたFISH解析を行う事により、染色条件の確立と特異的に染色される細菌細胞を見出していた。今年度は海綿の各ライフステージにおける共生様式を確認するため、組織切片を用いたFISHを試みた。海綿成体、胚、および放出直後の幼生を採取し直ちに固定後、パラフィン包埋して切片を作成した。前年度確立した染色条件によりハイブリダイズしたところ、胚および幼生内に特異的に染まる細菌塊が多数確認された。細菌塊の中央には海綿細胞核が存在する事から、これは細菌を特異的に共生させる細胞であるbacteriocyteであると考えられた。また、bacteriocyteと考えられる細菌塊は胚の段階で組織内に点在する事から、マイカロライド生産菌はbacteriocyteに共生する形で垂直伝播する事が予想された。また、bacteriocyte様の細胞には特異的に染色される細菌以外の菌は見られない事、また組織内にも他の細菌は少ない事から、選択的な垂直伝播が起きていると考えられた。
メタゲノム解析 マイカロライド共生菌メタゲノムのロングリードおよびショートリード解析結果をハイブリッドアセンブルする事で、約2.53Mbの完全長環状DNA配列を決定した。さらにショートリードをマッピングし、手動でミスアセンブルを除去していく事で、非常に精度の高いゲノム配列を完成し、詳細な機能解析を可能とした。その結果、本細菌は繰り返し配列が高頻度で含まれており、ゲノムも一般的な自由生活細菌と比較して縮小している事、複数の大型生合成遺伝子クラスターを有する事などが明らかになった。これらの事は、本細菌がミカーレ属海綿と極めて密接な共生関係を築きつつある途上であり、ゲノムの再構築が進んでいる状態であると考えられた。
日本学術振興会, 挑戦的研究(萌芽), 北海道大学, 18K19221

メタゲノム法を用いた環境機能分子およびその生合成遺伝子の探索と解析
科学研究費助成事業 若手研究(A)
2015年04月01日 - 2019年03月31日
藤田 雅紀; 今井 一郎; 木村 信忠
環境中での微生物間の化学的相互作用を解明する方法として、メタゲノム法、生合成、単離構造決定、バイオインフォマティクス、各種バイオアッセイを組み合わせる統合的なスキームを確立した。
その結果、赤潮・アオコの殺滅に関与する複数の細菌とその活性物質を同定した。また、環境中での生産と活性機構に関わる知見を得て、赤潮・アオコの生物学的防除の安全かつ効率的な利用につながる結果を得た。さらに、既知のシグナル物質とは全く異なる、新規のクオラムセンシングスーパーアゴニストを同定した。および、カイメン由来生理活性物質を生産する共生細菌の生合成遺伝子を同定し非常に新規性の高い系統であることを明らかにした。
日本学術振興会, 若手研究(A), 北海道大学, 15H05629

レポーターアッセイを用いた海洋メタゲノムからの新規生合成マシナリーの探索
科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
2013年04月01日 - 2015年03月31日
藤田 雅紀
グラム陰性細菌のクオラムセンシングに関与するLux系を改変したレポーターアッセイシステムを用いて、メタゲノム法による未培養微生物のクオラムセンシングに関して解析を行った。陸上由来のメタゲノムライブラリから、レポーターアッセイの結果を指標に取得した活性物質生産クローンは、予想されたアシルホモセリンラクトンの生合成遺伝子ではなく、モノオキシゲナーゼに相同性を示す遺伝子を保有していた。
また、活性クローンは青色色素であるインジゴを生産したが、インジゴにはクオラムセンシグ活性は無かった事から、他の微量生産物が活性本体であると考えられた。活性クローンを大量培養後、培養上清および菌体を有機溶媒で抽出し、レポーターアッセイ結果を指標に抽出物の分画を行った。逆相および順相クロマトグラフィー、複数の担体によるゲルろ過、4種のカラムを用いたHPLC分画により、40 Lの培養液から0.1 mg以下の活性物質を単一ピークとして取得した。
ESI-LC-MSによる分析から本物質は分子量293であり、また高分解質量分析結果からその分子式をC16H11N3O3と推測した。これは関連が推測されたインジゴと比較しNOH大きいものであった。また、重水素交換実験から、交換性プロトンを3個含むと推測された。
また、海洋メタゲノムライブラリ中に複数見出されたインジゴ生産クローンについても解析したところ、いずれもクオラムセンシング活性物質を生産していた。一方、それらクローンが保有する酸化酵素は陸上メタゲノム由来のものと比較して相同性が10％程度であり、配列的にはほぼ関連が無かった。以上のことから、未知のクオラムセンシング物質の生産には酵素の配列では無く、インジゴの産生能が大きく関与していることが推測された。また、陸上海洋問わず、広く分布する酵素により産生されることが示唆された。
日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 25108701

メタゲノム法による難培養海洋環境微生物からの新規生合成マシナリーの探索と物質生産
科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
2011年04月01日 - 2013年03月31日
藤田 雅紀
海洋メタゲノムからの新規生合成マシナリーの探索を目的に研究を行った。その結果、研究期間において多様な海洋サンプルから70万以上のメタゲノムクローンを構築した。また複数のスクリーニング系において合計200を超える活性クローンを見出し、そのうち13クローンについてはDNA配列の決定も行った。その中には既知遺伝子に相同性を示すものも存在した一方、配列相同性からは全く活性機構が不明なものも存在し、未知のマシナリーを取得できた可能性が期待された。
シデロフォア生産クローンのうち二つについてはその生産物を同定し、また生合成遺伝子クラスターに変異を加えることで、最終産物の構造変換を行うなどの応用研究も展開し、生物生産の多様化の例を示した。さらにメタゲノムから取得したbisucaberin 生合成酵素は未解明な点が多い、酵素による大環状化反応機構の解明に有用であると考え構造生物学的な検討を行っている。また、別のシデロフォア生産クローンの一つを解析したところ、生合成遺伝子クラスター全長が25 kbp程度と非常に大きく、これまでにメタゲノムから機能ベーススクリーニング法で取得した生合成遺伝子クラスターとしては最大級のものであった。未だ生産物の同定には至っていないが、配列上の特徴から新規化合物を生産していると考えられた。この結果はメタゲノム法で非常に大きな生合成遺伝子クラスターを取得可能であること、またそれを異宿主で発現し活性物質を生産できることを示すものであり、本方法論の実用性を示す例であると考える。
一方、抗菌活性クローンの一つが保有するDNA配列を決定したが、配列情報からは全く活性機構を予測することはできなかった。現在生産物の同定を進めているが、このように配列情報からは見出すことが困難な遺伝子を取得できたことは機能ベースメタゲノム法の有用な点であると考える。
日本学術振興会, 新学術領域研究(研究領域提案型), 北海道大学, 23108517

海洋メタゲノムからの金属結合物質シデロフォアの生合成遺伝子探索と異宿主生産
科学研究費助成事業 若手研究(B)
2011年 - 2012年
藤田 雅紀
これまでにメタゲノムライブラリから50以上のシデロフォア生産クローンを取得し、4つのクローンについてはその生合成遺伝子クラスター全長を決定した。また、取得した活性クローンのうち2つを解析しvibrioferrinとbisucaberinをその活性成分として同定した。Vibrioferrin生産クローンにおいては、本来の生産菌の40倍という高い生産量を示した。一方、bisucaberin生合成遺伝子はその配列から未解析微生物由来である事が示唆された。また、他のクローンからは遺伝子クラスター全長が25kbp以上という、機能ベースメタゲノム法で取得された生合成遺伝子クラスターとしては最大級のものを見出した。以上の成果は、機能性メタゲノム法による生合成遺伝子の探索と異宿主生産の実用性と応用性を示すものである。
日本学術振興会, 若手研究(B), 北海道大学, 23790134

アジア・太平洋海域における有用海洋生物資源調査
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
2009年 - 2011年
中尾 洋一; 堀 寛治; 酒井 隆一; 伏谷 伸宏; 松岡 俊二; 福沢 世傑; 脇本 敏幸; 藤田 雅紀; 高田 健太郎
ミクロネシア、ヴェトナム、およびインドネシアの3か国で海洋生物の採集を行い、合計515検体のサンプル採集が達成できた。これらのサンプルをもとに、可能な範囲で混合抽出物、共生微生物、遺伝子を取り出し、それぞれのライブラリーとして保存した。現在、本ライブラリーをもとに有用生物活性および活性本体のデータベース化を行っている。また、調査活動を通じて現地の研究機関との強固な共同研究体制も築くことができた。
日本学術振興会, 基盤研究(B), 早稲田大学, 21404010

生理活性を利用した海洋天然物の未同定生合成遺伝子の取得と物質生産
科学研究費助成事業 若手研究(スタートアップ)
2008年 - 2009年
藤田 雅紀
海洋メタゲノムを利用した有用物質生産を目標に、メタゲノムライブラリの作成技術構築から生産物質の同定まで一貫して行い、本方法論が実現可能であることを示した。本研究を通して、高品質海洋メタゲノムライブラリを約10万クローン作製し、また300以上の色素生産クローンを取得した。またそのうち20以上のクローンについて、その生合成遺伝子と生産物の同定を行った。
日本学術振興会, 若手研究(スタートアップ), 熊本大学, 20810022

抗転移剤の開発を指向した海洋無脊椎動物からのプロテアーゼ阻害物質の探索
科学研究費助成事業 特別研究員奨励費
2001年 - 2002年
藤田 雅紀
1.日本沿岸各地で採集された海洋無脊椎動物の抽出物、計2608検体について、ガン転移に深く関与していると考えられるカテプシンB、MT1-MMPおよびMMP2に対する阻害アッセイを行った。その結果それぞれの酵素に対して約8%のサンプルが阻害活性を示した。その中から、特に活性が強く、酵素間の選択性に優れたサンプルについてその活性本体の解明を試みた。
2.MT1-MMP阻害活性が認められた、高知県二並島産海綿Chribrochalina sp.の抽出物を、各種クロマトグラフィーで順次精製したところ、2つの阻害物質を単離した。阻害物質のスペクトルデータは、既知物質haplosamate Aと完全に一致したが、報告されたデータにいくつかの疑問点を認めたので、詳細な構造解析を行った。その結果、本物質の構造をリン酸化ステロールと改定した。なお、本物質はMT1-MMPをIC_<50>値150-180μg/mLで阻害した。
3.和歌山県五ヶ所湾産のPolyclinidae科ホヤの脂溶性抽出物に顕著なMMP2阻害活性が認められた。凍結資料を抽出後、各種クロマトグラフィーにより精製し、活性成分として1-(12-hydroxy)octadecanyl sulfateを単離した。その構造は各種スペクトルデータから、C_<18>の硫酸化アルコールと決定した。本物質はMMP2をIC_<50>値9.0μg/mLで阻害した。
4.高知県箱島産海綿、Callyspongia truncataからは、MT1-MMP阻害物質として、既知物質であるhalistanol sulfateとともに、新規化合物であるcallysponginol sulfate Aを得た。本物質の構造は、分光学および化学的な解析からC_<24>の硫酸化された不飽和脂肪酸であることが明らかになった。本阻害剤はMI1-分光学MMPをIC_<50>値15.0μg/mLで阻害した。
日本学術振興会, 特別研究員奨励費, 東京大学, 01J05978