SEARCH

検索詳細

奥山　正幸 (オクヤマ　マサユキ)

農学研究院　基盤研究部門　応用生命科学分野教授

研究者基本情報

■ 学位
  • 博士（農学）, 北海道大学
■ URL
researchmap URLホームページURL■ ID 各種
J-Global ID■ 研究キーワード・分野
研究キーワード
  • 糖質分解酵素
  • 分子進化
  • 基質認識
  • α-グルコシダーゼ
  • 立体構造解析
  • 触媒メカニズム
  • α-グルコシダーゼII
  • 糖転移反応
  • 自殺基質
  • タンパク質工学
  • タンパク質の分子進化
  • 小胞体グルコシダーゼ
  • 触媒機構
  • 基質特異性
  • 糖質加水分解酵素
  • デキストラナーゼ
  • 部位特異的変異
  • 糖転移
  • 国際情報交換
  • 蜂蜜生成
  • 蛋白質工学
  • アジア原産ミツバチ
  • アミノ酸置換
  • 多糖合成酵素
  • タイ:韓国
  • 構造因子
  • 酵素反応
  • グリコシダーゼ
  • 合成酵素
  • オリゴ糖合成
  • 分子酵素学
  • protein engineering
  • molecular enzymology
研究分野
  • ライフサイエンス, 応用分子細胞生物学
  • ライフサイエンス, 応用生物化学
■ 担当教育組織

経歴

■ 経歴
経歴
  • 2022年04月 - 現在
    北海道大学大学院農学研究院, 基盤研究部門応用生命科学分野, 教授
  • 2014年
    北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師
  • 2007年04月 - 2012年03月
    北海道大学大学院, 農学研究科助, 教
  • 2002年06月 - 2007年03月
    北海道大学大学院, 農学研究科, 助手
学歴
  • 1998年04月 - 2001年03月, 北海道大学大学院, 農学研究科, 農芸化学専攻博士課程
  • 1996年04月 - 1998年03月, 北海道大学大学院, 農学研究科, 農芸化学専攻修士課程
  • 1993年04月 - 1996年03月, 北海道大学, 農学部, 応用生命科学科
委員歴
  • 2021年03月 - 現在
    日本農芸化学会, ダイバーシティ推進委員会, 学協会
  • 2020年03月 - 現在
    日本農芸化学会北海道支部, 支部幹事（庶務担当）, 学協会
  • 2015年 - 現在
    日本応用糖質科学会, 企画委員, 学協会
  • 2015年 - 現在
    日本応用糖質科学会, 和文誌編集員, 学協会
  • 2017年03月 - 2021年02月
    日本農芸化学会, BBB編集委員, 学協会
  • 2015年08月 - 2017年
    日本農芸化学会, 学術活動強化委員会 幹事, 学協会
  • 2010年
    日本応用糖質科学会, 電子情報編集委員, 学協会

研究活動情報

■ 受賞
  • 2012年, Committee of Plant and Seaweed Polysaccharides Workshop, Committee of Plant and Seaweed Polysaccharides Workshop, Poster prize
    奥山 正幸
  • 2010年, 農芸化学奨励賞
    日本国
  • 2007年, CBM7 7th Carbohydrate Bioengineering Meeting Poster prize
  • 2003年, 日本農芸化学会, 日本農芸化学会BBB論文賞
    奥山 正幸
■ 論文
  • Porcine serum maltase-glucoamylase: structure, kinetics, and inhibition
    Ken Watanabe; Takayoshi Tagami; Chihiro Biwa; Masato Kawasaki; Naruhiko Adachi; Toshio Moriya; Toshiya Senda; Masayuki Okuyama
    Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 41, 1, Informa UK Limited, 2026年01月14日
    研究論文（学術雑誌）
  • Structural basis of transglucosylation in dextran dextrinase, a homolog of anomer-inverting GH15 glucoside hydrolases.
    Takayoshi Tagami; Wataru Saburi; Juri Sadahiro; Yuya Kumagai; Weeranuch Lang; Naohiro Matsugaki; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura
    The Journal of biological chemistry, 301, 9, 110541, 110541, 2025年07月30日, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Bacterial exopolysaccharide, dextran, primarily composed of α-(1→6)-linked d-glucosyl residues, is synthesized from α-(1→4)-glucan dextrin or sucrose through successive anomer-retaining transglucosylation reactions by dextran dextrinase (DDase) or dextransucrase, respectively. Although the structure-function relationship of dextransucrase has been extensively studied, that of DDase remains largely unknown. Herein, we revealed the Gluconobacter oxydans DDase structural basis through biochemical and structural analyses. The DDase comprises 1284 residues, with its N-terminal 902 residues being functionally essential. Crystal structure analysis of the minimal active DDase (Δ382C) complex with the pseudo-maltotetraose inhibitor, acarbose, revealed its homodimeric structure. A Δ382C protomer contains two β-sandwich domains, N1 and N2, and an (α/α)6-barrel domain A. Surprisingly, domains N2, A, and the helix-loop-helix connecting them structurally resemble those of bacterial anomer-inverting glucohydrolases in glycoside hydrolase family 15 (GH15). Domain N1 primarily forms intra- and inter-subunit domain interfaces. The DDase acarbose-binding residues in subsite -1 are conserved with GH15 glucohydrolases. The DDase Glu671 and Glu858 are positioned similarly to the GH15 glucohydrolase general acid and base catalysts, respectively. However, Glu858 is approximately 1.2 to 1.6 Å closer to the acarbose equivalent anomeric carbon, facilitating its role as a nucleophilic catalyst in the double displacement mechanism. The catalytic residue functions were biochemically confirmed using mutant enzymes. Spatial position of Glu858 is arranged by the local structure of the α11→α12 loop and subunit interactions involving domain N1. Enzymes classified in the same GH family catalyze reactions with different mechanisms, anomer-inverting or -retaining, due to differences in their catalytic residue spatial arrangement.
  • Mutant β-fructofuranosidase synthesizing blastose [β-d-Fruf-(2→6)-d-Glcp].
    Atsuki Takagi; Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama
    Enzyme and microbial technology, 180, 110500, 110500, 2024年10月, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Fructooligosaccharides (FOS) are leading prebiotics that help keep the gut healthy and aid wellness by stimulating the growth and activity of beneficial intestinal bacteria. The best-studied FOS are inulin-type FOS, mainly oligosaccharides with β-Fruf-(2→1)-Fruf linkages, including 1-kestose [β-Fruf-(2→1)-β-Fruf-(2↔1)-α-Glcp] and nystose [β-Fruf-(2→1)-β-Fruf-(2→1)-β-Fruf-(2↔1)-α-Glcp]. However, the properties of other types of FOS-levan-type FOS with β-Fruf-(2→6)-Fruf linkages and neo-type FOS with β-Fruf-(2→6)-Glcp linkages-remain ambiguous because efficient methods have not been established for their synthesis. Here, using site-saturation mutation of residue His79 of β-fructofuranosidase from Zymomonas mobilis NBRC13756, we successfully obtained a mutant β-fructofuranosidase that specifically produces neo-type FOS. The H79G enzyme variant loses the native β-Fruf-(2→1)-Fru-transfer ability (which produces 1-kestose), and instead has β-Fruf-(2→6)-Glc-transfer ability and produces neokestose. Its hydrolytic activity specific to the β-Fruf-(2↔1)-α-Glcp bond of neokestose then yields blastose [β-Fruf-(2→6)-Glcp]. The enzyme produces 0.4 M blastose from 1.0 M sucrose (80 % of the theoretical yield). The production system for blastose established here will contribute to the elucidation of the physiological functions of this disaccharide.
  • Substrate Specificity of GH29 α-L-Glucosidases from Cecembia lonarensis.
    Hye-Jin Kang; Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama
    Journal of applied glycoscience, 71, 3, 91, 94, 2024年, ［国内誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, We recently found two α-L-glucosidases, which can hydrolyze p-nitrophenyl α-L-glucopyranoside (PNP L-Glc) rather than p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside, in glycoside hydrolase family 29. This study evaluated their substrate specificity for p-nitrophenyl α-L-rhamnopyranoside (PNP L-Rha), α-L-quinovopyranoside (PNP L-Qui), and α-L-xylopyranoside (PNP L-Xyl), of which structure is similar to PNP L-Glc. The two α-L-glucosidases had little activity toward PNP L-Rha. They exhibited higher k cat/K m values for PNP L-Qui but smaller for PNP L-Xyl than for PNP L-Glc. The molecular docking studies indicated that these specificities were correlated well with the active-site structure of the α-L-glucosidases. The finding that α-L-quinovoside, which has been suggested to occur in nature, is also a substrate for α-L-glucosidases indicates that this enzyme are not solely dedicated to α-L-glucoside hydrolysis.
  • Structural and mutational analysis of glycoside hydrolase family 1 Br2 β-glucosidase derived from bovine rumen metagenome
    Wilaiwan Kaenying; Takayoshi Tagami; Eukote Suwan; Chariwat Pitsanuwong; Sinchai Chomngam; Masayuki Okuyama; Palangpon Kongsaeree; Atsuo Kimura; Prachumporn T. Kongsaeree
    Heliyon, 9, 11, e21923, e21923, Elsevier BV, 2023年11月, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Ruminant animals rely on the activities of β-glucosidases from residential microbes to convert feed fibers into glucose for further metabolic uses. In this report, we determined the structures of Br2, which is a glycoside hydrolase family 1 β-glucosidase from the bovine rumen metagenome. Br2 folds into a classical (β/α)8-TIM barrel domain but displays unique structural features at loop β5→α5 and α-helix 5, resulting in different positive subsites from those of other GH1 enzymes. Br2 exhibited the highest specificity toward laminaritriose, suggesting its involvement in β-glucan hydrolysis in digested feed. We then substituted the residues at subsites +1 and + 2 of Br2 with those of Halothermothrix orenii β-glucosidase. The C170E and C221T mutations provided favorable interactions with glucooligosaccharide substrates at subsite +2, while the A219N mutation probably improved the substrate preference for cellobiose and gentiobiose relative to laminaribiose at subsite +1. The N407Y mutation increased the affinity toward cellooligosaccharides. These results give further insights into the molecular determinants responsible for substrate specificity in GH1 β-glucosidases and may provide a basis for future enzyme engineering applications.
  • Tunable structure of chimeric isomaltomegalosaccharides with double α-(1 → 4)-glucosyl chains enhances the solubility of water-insoluble bioactive compounds
    Weeranuch Lang; Takayoshi Tagami; Yuya Kumagai; Seiya Tanaka; Hye-Jin Kang; Masayuki Okuyama; Wataru Saburi; Haruhide Mori; Tohru Hira; Chaehun Lee; Takuya Isono; Toshifumi Satoh; Hiroshi Hara; Takayuki Kurokawa; Nobuo Sakairi; Yoshiaki Yuguchi; Atsuo Kimura
    Carbohydrate Polymers, 319, 121185, 121185, Elsevier BV, 2023年11月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Isomaltomegalosaccharides with α-(1 → 4) and α-(1 → 6)-segments solubilize water-insoluble ligands since the former complexes with the ligand and the latter solubilizes the complex. Previously, we enzymatically synthesized isomaltomegalosaccharide with a single α-(1 → 4)-segment at the reducing end (S-IMS) by dextran dextrinase (DDase), but the chain length [average degree of polymerization (DP) ≤ 9] was insufficient for strong encapsulation. We hypothesized that the conjugation of longer α-(1 → 4)-segment afforded the promising function although DDase is incapable to do so. In this study, the cyclodextrin glucanotransferase-catalyzed coupling reaction of α-cyclodextrin to S-IMS synthesized a new α-(1 → 4)-segment at the nonreducing end (N-4S) of S-IMS to form D-IMS [IMS harboring double α-(1 → 4)-segments]. The length of N-4S was modulated by the ratio between α-cyclodextrin and S-IMS, generating N-4Ss with DPs of 7-50. Based on phase-solubility analysis, D-IMS-28.3/13/3 bearing amylose-like helical N-4S with DP of 28.3 displayed a water-soluble complex with aromatic drugs and curcumin. Small-angle X-ray scattering revealed the chain adapted to rigid in solution in which the radius of gyration was estimated to 2.4 nm. Furthermore, D-IMS with short N-4S solubilized flavonoids of less-soluble multifunctional substances. In our research, enzyme-generated functional biomaterials from DDase were developed to maximize the hydrophobic binding efficacy towards water-insoluble bioactive compounds.
  • Partial depolymerization of tamarind seed xyloglucan and its functionality toward enhancing the solubility of curcumin
    Weeranuch Lang; Takayoshi Tagami; Hye-Jin Kang; Masayuki Okuyama; Nobuo Sakairi; Atsuo Kimura
    Carbohydrate Polymers, 307, 120629, 120629, Elsevier BV, 2023年05月, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Polysaccharides of tamarind seed, a byproduct of the tamarind pulp industry, displayed a potential solubility improvement of lipophilic bioactive molecules but their textural characteristics hinder the dietary formulation. In contrast, the commonly available xyloglucan oligosaccharides (XOSs) with degrees of polymerization (DPs) of 7, 8, and 9 were too short to maintain their ability. The binding capacity of the between sizes is unknown due to a lack of appropriate preparation. We prepared xyloglucan megalosaccharides (XMSs) by partial depolymerization, where term megalosaccharide (MS) defines the middle chain-length saccharide between DPs 10 and 100. Digestion with fungal cellulase enabled reproducible active XMSs. Further identification of pure XMS segments indicated that XMS-B has an average DP of 17.2 (Gal3Glc8Xyl6) with a branched dimer of XOS 8 and 9 and was free of side-chain arabinose, the residue influencing high viscosity. Curcumin, a bioactive pigment, has poor bioavailability because of its water insolubility. XMSs with average DPs of 15.4-24.3 have similarly sufficient capacities to solubilize curcumin. The solubility of curcumin was improved 180-fold by the addition of 50 %, w/v, XMSs, which yielded a clear yellow liquid. Our findings indicated that XMSs were a promising added-value agent in foods and pharmaceuticals for the oral intake of curcumin.
  • Nonreducing terminal chimeric isomaltomegalosaccharide and its integration with azoreductase for the remediation of soil-contaminated lipophilic azo dyes
    Weeranuch Lang; Sarote Sirisansaneeyakul; Takayoshi Tagami; Hye-Jin Kang; Masayuki Okuyama; Nobuo Sakairi; Atsuo Kimura
    Carbohydrate Polymers, 305, 120565, 120565, Elsevier BV, 2023年04月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Lipophilic azo dyes are practically water-insoluble, and their dissolution by organic solvents and surfactants is harmful to biological treatment with living cells and enzymes. This study aimed to evaluate the feasibility of a newly synthesized nonreducing terminal chimeric isomaltomegalosaccharide (N-IMS) as a nontoxic solubilizer of four simulated lipophilic azo dye wastes for enzymatic degradation. N-IMS bearing a helical α-(1 → 4)-glucosidic segment derived from a donor substrate α-cyclodextrin was produced by a coupling reaction of cyclodextrin glucanotransferase. Inclusion complexing by N-IMS overcame the solubility issue with equilibrium constants of 1786-242 M-1 (methyl yellow > ethyl red > methyl red > azo violet). Circular dichroism spectra revealed the axial alignment of the aromatic rings in the N-IMS cavity, while UV-visible absorption quenching revealed that the azo bond of methyl yellow was particularly induced. Desorption of the dyes from acidic and neutral soils was specific to aqueous organic over alkali extraction. The dissolution kinetics of the incorporated dyes followed a sigmoid pattern facilitating the subsequent decolorization process with azoreductase. It was demonstrated that after soil extraction, the solid dyes dissolved with N-IMS assistance and spontaneously digested by coupled azoreductase/glucose dehydrogenase (for a cofactor regeneration system) with the liberation of the corresponding aromatic amine.
  • Formulation and evaluation of a novel megalomeric microemulsion from tamarind seed xyloglucan-megalosaccharides for improved high-dose quercetin delivery
    Weeranuch Lang; Debashish Mondol; Aphichat Trakooncharoenvit; Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama; Tohru Hira; Nobuo Sakairi; Atsuo Kimura
    Food Hydrocolloids, 137, 108430, 108430, Elsevier BV, 2023年04月, ［査読有り］
    研究論文（学術雑誌）
  • Crystal structure and identification of amino acid residues for catalysis and binding of GH3 AnBX β-xylosidase from Aspergillus niger
    Wilaiwan Kaenying; Khuanjarat Choengpanya; Takayoshi Tagami; Pakorn Wattana-Amorn; Weeranuch Lang; Masayuki Okuyama; Yaw-Kuen Li; Atsuo Kimura; Prachumporn T. Kongsaeree
    Applied Microbiology and Biotechnology, 107, 7-8, 2335, 2349, Springer Science and Business Media LLC, 2023年03月06日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, β-Xylosidases catalyze the hydrolysis of xylooligosaccharides to xylose in the final step of hemicellulose degradation. AnBX, which is a GH3 β-xylosidase from Aspergillus niger, has a high catalytic efficiency toward xyloside substrates. In this study, we report the three-dimensional structure and the identification of catalytic and substrate binding residues of AnBX by performing site-directed mutagenesis, kinetic analysis, and NMR spectroscopy-associated analysis of the azide rescue reaction. The structure of the E88A mutant of AnBX, determined at 2.5-Å resolution, contains two molecules in the asymmetric unit, each of which is composed of three domains, namely an N-terminal (β/α)8 TIM-barrel-like domain, an (α/β)6 sandwich domain, and a C-terminal fibronectin type III domain. Asp288 and Glu500 of AnBX were experimentally confirmed to act as the catalytic nucleophile and acid/base catalyst, respectively. The crystal structure revealed that Trp86, Glu88 and Cys289, which formed a disulfide bond with Cys321, were located at subsite -1. Although the E88D and C289W mutations reduced catalytic efficiency toward all four substrates tested, the substitution of Trp86 with Ala, Asp and Ser increased the substrate preference for glucoside relative to xyloside substrates, indicating that Trp86 is responsible for the xyloside specificity of AnBX. The structural and biochemical information of AnBX obtained in this study provides invaluable insight into modulating the enzymatic properties for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. KEY POINTS: • Asp288 and Glu500 of AnBX are the nucleophile and acid/base catalyst, respectively • Glu88 and the Cys289-Cys321 disulfide bond are crucial for the catalytic activity of AnBX • The W86A and W86S mutations in AnBX increased the preference for glucoside substrates.
  • Discovery of α-l-Glucosidase Raises the Possibility of α-l-Glucosides in Nature
    Rikako Shishiuchi; Hyejin Kang; Takayoshi Tagami; Yoshitaka Ueda; Weeranuch Lang; Atsuo Kimura; Masayuki Okuyama
    ACS Omega, 7, 50, 47411, 47423, American Chemical Society (ACS), 2022年12月09日, ［査読有り］, ［責任著者］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Glucose, a common monosaccharide in nature, is dominated by the d-enantiomer. Meanwhile, the discovery of l-glucose-utilizing bacteria and the elucidation of their metabolic pathways 10 years ago suggests that l-glucose exists naturally. Most carbohydrates exist as glycosides rather than monosaccharides; therefore, we expected that nature also contains l-glucosides. Sequence analysis within glycoside hydrolase family 29 led us to identify two α-l-glucosidases, ClAgl29A and ClAgl29B, derived from Cecembia lonarensis LW9. ClAgl29A and ClAgl29B exhibited higher K m, k cat, and k cat/K m values for p-nitrophenyl α-l-glucoside than that for p-nitrophenyl α-l-fucoside. Structural analysis of ClAgl29B in complex with l-glucose showed that these enzymes have an active-site pocket that preferentially binds α-l-glucoside, but excludes α-l-fucoside. These results suggest that ClAgl29A and ClAgl29B evolved to hydrolyze α-l-glucoside, implying the existence of α-l-glucoside in nature. Furthermore, α-l-glucosidic linkages (α-l-Glc-(1 → 3)-l-Glc, α-l-Glc-(1 → 2)-l-Glc, and α-l-Glc-(1 → 6)-l-Glc) were synthesized by the transglucosylation activity of ClAgl29A and ClAgl29B. We believe that this study will lead to new research on α-l-glucosides, including determining the physiological effects on humans, and the discovery of novel α-l-glucoside-related enzymes.
  • Physicochemical functionality of chimeric isomaltomegalosaccharides with α-(1 → 4)-glucosidic segments of various lengths
    Weeranuch Lang; Yuya Kumagai; Shinji Habu; Juri Sadahiro; Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama; Shinichi Kitamura; Nobuo Sakairi; Atsuo Kimura
    Carbohydrate Polymers, 291, 119562, 119562, Elsevier BV, 2022年09月, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Isomaltomegalosaccharide (IMS) is a long chimeric glucosaccharide composed of α-(1 → 6)- and α-(1 → 4)-linked segments at nonreducing and reducing ends, respectively; the hydrophilicity and hydrophobicity of these segments are expected to lead to bifunctionality. We enzymatically synthesized IMS with average degrees of polymerization (DPs) of 15.8, 19.3, and 23.5, where α-(1 → 4)-segments had DPs of 3, 6, and 9, respectively. IMS exhibited considerably higher water solubility than maltodextrin because of the α-(1 → 6)-segment and an identical resistance to thermal degradation as short dextran. Interaction of IMS with a fluorescent probe of 2-p-toluidinylnaphthalene-6-sulfonate demonstrated that IMS was more hydrophobic than maltodextrin, where the degree of hydrophobicity increased as DP of α-(1 → 4)-segment increased (9 > 6 > 3). Fluorescent pyrene-estimating polarity of IMS was found to be similar to that of methanol or 1-butanol. The bifunctional IMS enhanced the water solubility of quercetin-3-O-glucoside and quercetin: the solubilization of less-soluble bioactive substances is beneficial in carbohydrate industry.
  • Characterization of an Unknown Region Linked to the Glycoside Hydrolase Family 17 β-1,3-Glucanase of Vibrio vulnificus Reveals a Novel Glucan-Binding Domain
    Yuya Kumagai; Hideki Kishimura; Weeranuch Lang; Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    Marine Drugs, 20, 4, 250, 250, MDPI AG, 2022年03月31日, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, The glycoside hydrolase family 17 β-1,3-glucanase of Vibrio vulnificus (VvGH17) has two unknown regions in the N- and C-termini. Here, we characterized these domains by preparing mutant enzymes. VvGH17 demonstrated hydrolytic activity of β-(1→3)-glucan, mainly producing laminaribiose, but not of β-(1→3)/β-(1→4)-glucan. The C-terminal-truncated mutants (ΔC466 and ΔC441) showed decreased activity, approximately one-third of that of the WT, and ΔC415 lost almost all activity. An analysis using affinity gel containing laminarin or barley β-glucan revealed a shift in the mobility of the ΔC466, ΔC441, and ΔC415 mutants compared to the WT. Tryptophan residues showed a strong affinity for carbohydrates. Three of four point-mutations of the tryptophan in the C-terminus (W472A, W499A, and W542A) showed a reduction in binding ability to laminarin and barley β-glucan. The C-terminus was predicted to have a β-sandwich structure, and three tryptophan residues (Trp472, Trp499, and Trp542) constituted a putative substrate-binding cave. Linker and substrate-binding functions were assigned to the C-terminus. The N-terminal-truncated mutants also showed decreased activity. The WT formed a trimer, while the N-terminal truncations formed monomers, indicating that the N-terminus contributed to the multimeric form of VvGH17. The results of this study are useful for understanding the structure and the function of GH17 β-1,3-glucanases.
  • A practical approach to producing isomaltomegalosaccharide using dextran dextrinase from Gluconobacter oxydans ATCC 11894.
    Weeranuch Lang; Yuya Kumagai; Juri Sadahiro; Wataru Saburi; Rakrudee Sarnthima; Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Nobuo Sakairi; Doman Kim; Atsuo Kimura
    Applied microbiology and biotechnology, 106, 2, 689, 698, Springer Science and Business Media {LLC}, 2022年01月, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Dextran dextrinase (DDase) catalyzes formation of the polysaccharide dextran from maltodextrin. During the synthesis of dextran, DDase also generates the beneficial material isomaltomegalosaccharide (IMS). The term megalosaccharide is used for a saccharide having DP = 10-100 or 10-200 (DP, degree of polymerization). IMS is a chimeric glucosaccharide comprising α-(1 → 6)- and α-(1 → 4)-linked portions at the nonreducing and reducing ends, respectively, in which the α-(1 → 4)-glucosyl portion originates from maltodextrin of the substrate. In this study, IMS was produced by a practical approach using extracellular DDase (DDext) or cell surface DDase (DDsur) of Gluconobacter oxydans ATCC 11894. DDsur was the original form, so we prepared DDext via secretion from intact cells by incubating with 0.5% G6/G7 (maltohexaose/maltoheptaose); this was followed by generation of IMS from various concentrations of G6/G7 substrate at different temperatures for 96 h. However, IMS synthesis by DDext was limited by insufficient formation of α-(1 → 6)-glucosidic linkages, suggesting that DDase also catalyzes elongation of α-(1 → 4)-glucosyl chain. For production of IMS using DDsur, intact cells bearing DDsur were directly incubated with 20% G6/G7 at 45 °C by optimizing conditions such as cell concentration and agitation efficiency, which resulted in generation of IMS (average DP = 14.7) with 61% α-(1 → 6)-glucosyl content in 51% yield. Increases in substrate concentration and agitation efficiency were found to decrease dextran formation and increase IMS production, which improved the reaction conditions for DDext. Under modified conditions (20% G6/G7, agitation speed of 100 rpm at 45 °C), DDext produced IMS (average DP = 14.5) with 65% α-(1 → 6)-glucosyl content in a good yield of 87%. KEY POINTS: • Beneficial IMS was produced using thermostabilized DDase. • Optimum conditions for reduced dextran formation were successfully determined. • A practical approach was established to provide IMS with a great yield of 87%.
  • Structural insights reveal the second base catalyst of isomaltose glucohydrolase.
    Takayoshi Tagami; Minghao Chen; Yuta Furunaga; Asako Kikuchi; Juri Sadahiro; Weeranuch Lang; Masayuki Okuyama; Yoshikazu Tanaka; Tomohito Iwasaki; Min Yao; Atsuo Kimura
    The FEBS journal, 289, 4, 1118, 1134, 2021年10月19日, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Glycoside hydrolase family 15 (GH15) inverting enzymes contain two glutamate residues functioning as a general acid catalyst and a general base catalyst, for isomaltose glucohydrolase (IGHase), Glu178 and Glu335, respectively. Generally, a two catalytic residue-mediated reaction exhibits a typical bell-shaped pH-activity curve. However, IGHase is found to display atypical non-bell-shaped pH-kcat and pH-kcat /Km profiles, theoretically better-fitted to a three catalytic residue-associated pH-activity curve. We determined the crystal structure of IGHase by the single-wavelength anomalous dispersion method using sulfur atoms and the cocrystal structure of a catalytic base mutant E335A with isomaltose. Although the activity of E335A was undetectable, the electron density observed in its active site pocket did not correspond to an isomaltose but a glycerol and a β-glucose, cryoprotectant and hydrolysis product, respectively. Our structural and biochemical analyses of several mutant enzymes suggest that Tyr48 acts as a second catalytic base catalyst. Y48F mutant displayed almost equivalent specific activity to a catalytic acid mutant E178A. Tyr48, highly conserved in all GH15 members, is fixed by another Tyr residue in many GH15 enzymes; the latter Tyr is replaced by Phe290 in IGHase. The pH profile of F290Y mutant changed to a bell-shaped curve, suggesting that Phe290 is a key residue distinguishing Tyr48 of IGHase from other GH15 members. Furthermore, F290Y is found to accelerate the condensation of isomaltose from glucose by modifying a hydrogen-bonding network between Tyr290-Tyr48-Glu335. The present study indicates that the atypical Phe290 makes Tyr48 of IGHase unique among GH15 enzymes.
  • Molecular insight into regioselectivity of transfructosylation catalyzed by GH68 levansucrase and β-fructofuranosidase.
    Masayuki Okuyama; Ryo Serizawa; Masanari Tanuma; Asako Kikuchi; Juri Sadahiro; Takayoshi Tagami; Weeranuch Lang; Atsuo Kimura
    The Journal of biological chemistry, 296, 100398, 100398, Elsevier {BV}, 2021年02月08日, ［査読有り］, ［筆頭著者］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Glycoside hydrolase family 68 (GH68) enzymes catalyze β-fructosyltransfer from sucrose to another sucrose, so-called transfructosylation. Although regioselectivity of transfructosylation is divergent in GH68 enzymes, there is insufficient information available on the structural factor(s) involved in the selectivity. Here, we found two GH68 enzymes, β-fructofuranosidase (FFZm) and levansucrase (LSZm), encoded tandemly in the genome of Zymomonas mobilis, displayed different selectivity: FFZm catalyzed the β-(2→1)-transfructosylation (1-TF), whereas LSZm did both of 1-TF and β-(2→6)-transfructosylation (6-TF). We identified His79FFZm and Ala343FFZm and their corresponding Asn84LSZm and Ser345LSZm respectively as the structural factors for those regioselectivities. LSZm with the respective substitution of FFZm-type His and Ala for its Asn84LSZm and Ser345LSZm (N84H/S345A-LSZm) lost 6-TF and enhanced 1-TF. Conversely, the LSZm-type replacement of His79FFZm and Ala343FFZm in FFZm (H79N/A343S-FFZm) almost lost 1-TF and acquired 6-TF. H79N/A343S-FFZm exhibited the selectivity like LSZm but did not produce the β-(2→6)-fructoside-linked levan and/or long levanooligosaccharides that LSZm did. We assumed Phe189LSZm to be a responsible residue for the elongation of levan chain in LSZm and mutated the corresponding Leu187FFZm in FFZm to Phe. An H79N/L187F/A343S-FFZm produced a higher quantity of long levanooligosaccharides than H79N/A343S-FFZm (or H79N-FFZm), although without levan formation, suggesting that LSZm has another structural factor for levan production. We also found that FFZm generated a sucrose analog, β-D-fructofuranosyl α-D-mannopyranoside, by β-fructosyltransfer to d-mannose and regarded His79FFZm and Ala343FFZm as key residues for this acceptor specificity. In summary, this study provides insight into the structural factors of regioselectivity and acceptor specificity in transfructosylation of GH68 enzymes.
  • Novel α-1,3/α-1,4-Glucosidase from Aspergillus niger Exhibits Unique Transglucosylation to Generate High Levels of Nigerose and Kojibiose.
    Ma M; Okuyama M; Tagami T; Kikuchi A; Klahan P; Kimura A
    Journal of agricultural and food chemistry, 67, 12, 3380, 3388, 2019年03月27日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, α-Glucosidase from Aspergillus niger (AgdA; typical α-1,4-glucosidase) is known to industrially produce α-(1→6)-glucooligosaccharides. This fungus also has another α-glucosidase-like protein, AgdB. To learn its function, wild-type AgdB was expressed in Pichia pastoris. However, the enzyme displayed two electrophoretic forms due to heterogeneity of N-glycosylation at Asn354. The deglycosylation mutant N354D shared the same properties with wild-type AgdB. N354D demonstrated hydrolytic specificity toward α-(1→3)- and α-(1→4)-glucosidic linkages, indicating that AgdB is an α-1,3-/α-1,4-glucosidase. N354D-catalyzed transglucosylation from maltose was analyzed in short- and long-term reactions, enabling us to learn the transglucosylation specificity and product accumulation, respectively. A short-term reaction (<15 min) synthesized 3II- O-α-glucosyl-maltose and maltotriose, indicating α-1,3-/α-1,4-transferring specificity. A long-term reaction (<24 h) accumulated kojibiose and nigerose using formed glucose as an acceptor substrate. AgdA and AgdB are distinct α-glucosidases. At a high concentration of glucose added exogenously, AgdB largely generated the rare sugars kojibiose and nigerose (exhibiting beneficial physiological functions) with 19% and 24% yields from maltose, respectively.
  • Engineered dextranase from Streptococcus mutans enhances the production of longer isomaltooligosaccharides.
    Patcharapa Klahan; Masayuki Okuyama; Kohei Jinnai; Min Ma; Asako Kikuchi; Yuya Kumagai; Takayoshi Tagami; Atsuo Kimura
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 82, 9, 1480, 1487, Informa {UK} Limited, 2018年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）, Herein, we investigated enzymatic properties and reaction specificities of Streptococcus mutans dextranase, which hydrolyzes α-(1→6)-glucosidic linkages in dextran to produce isomaltooligosaccharides. Reaction specificities of wild-type dextranase and its mutant derivatives were examined using dextran and a series of enzymatically prepared p-nitrophenyl α-isomaltooligosaccharides. In experiments with 4-mg·mL-1 dextran, isomaltooligosaccharides with degrees of polymerization (DP) of 3 and 4 were present at the beginning of the reaction, and glucose and isomaltose were produced by the end of the reaction. Increased concentrations of the substrate dextran (40 mg·mL-1) yielded isomaltooligosaccharides with higher DP, and the mutations T558H, W279A/T563N, and W279F/T563N at the -3 and -4 subsites affected hydrolytic activities of the enzyme, likely reflecting decreases in substrate affinity at the -4 subsite. In particular, T558H increased the proportion of isomaltooligosaccharide with DP of 5 in hydrolysates following reactions with 4-mg·mL-1 dextran.Abbreviations CI: cycloisomaltooligosaccharide; CITase: CI glucanotransferase; CITase-Bc: CITase from Bacillus circulans T-3040; DP: degree of polymerization of glucose unit; GH: glycoside hydrolase family; GTF: glucansucrase; HPAEC-PAD: high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection; IG: isomaltooligosaccharide; IGn: IG with DP of n (n, 2‒5); PNP: p-nitrophenol; PNP-Glc: p-nitrophenyl α-glucoside; PNP-IG: p-nitrophenyl isomaltooligosaccharide; PNP-IGn: PNP-IG with DP of n (n, 2‒6); SmDex: dextranase from Streptococcus mutans; SmDexTM: S. mutans ATCC25175 SmDex bearing Gln100‒Ile732.
  • A novel glycoside hydrolase family 97 enzyme: Bifunctional β-l-arabinopyranosidase/α-galactosidase from Bacteroides thetaiotaomicron.
    Kikuchi A; Okuyama M; Kato K; Osaki S; Ma M; Kumagai Y; Matsunaga K; Klahan P; Tagami T; Yao M; Kimura A
    Biochimie, 142, 41, 50, 2017年11月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Substrate recognition of the catalytic α-subunit of glucosidase II from Schizosaccharomyces pombe.
    Okuyama M; Miyamoto M; Matsuo I; Iwamoto S; Serizawa R; Tanuma M; Ma M; Klahan P; Kumagai Y; Tagami T; Kimura A
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 81, 8, 1503, 1511, 2017年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Effects of mutation of Asn694 in Aspergillus niger α-glucosidase on hydrolysis and transglucosylation.
    Ma M; Okuyama M; Sato M; Tagami T; Klahan P; Kumagai Y; Mori H; Kimura A
    Applied microbiology and biotechnology, 101, 16, 6399, 6408, 2017年08月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Efficient synthesis of α-galactosyl oligosaccharides using a mutant Bacteroides thetaiotaomicron retaining α-galactosidase (BtGH97b).
    Okuyama M; Matsunaga K; Watanabe KI; Yamashita K; Tagami T; Kikuchi A; Ma M; Klahan P; Mori H; Yao M; Kimura A
    The FEBS journal, 284, 5, 766, 783, 2017年03月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Functional characterization of UDP-rhamnose-dependent rhamnosyltransferase involved in anthocyanin modification, a key enzyme determining blue coloration in Lobelia erinus.
    Yang-Hsin Hsu; Takayoshi Tagami; Kana Matsunaga; Masayuki Okuyama; Takashi Suzuki; Naonobu Noda; Masahiko Suzuki; Hanako Shimura
    The Plant journal : for cell and molecular biology, 89, 2, 325, 337, 2017年01月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Molecular insights into the mechanism of thermal stability of actinomycete mannanase.
    Yuya Kumagai; Misugi Uraji; Kun Wan; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura; Tadashi Hatanaka
    FEBS letters, 590, 17, 2862, 9, 2016年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Kinetic properties and substrate inhibition of α-galactosidase from Aspergillus niger.
    Liao J; Okuyama M; Ishihara K; Yamori Y; Iki S; Tagami T; Mori H; Chiba S; Kimura A
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 80, 9, 1747, 52, 2016年09月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Two Novel Glycoside Hydrolases Responsible for the Catabolism of Cyclobis-(1→6)-α-nigerosyl.
    Tagami T; Miyano E; Sadahiro J; Okuyama M; Iwasaki T; Kimura A
    The Journal of biological chemistry, 291, 32, 16438, 47, 2016年08月05日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Heat treatment of curdlan enhances the enzymatic production of biologically active β-(1,3)-glucan oligosaccharides.
    Kumagai Y; Okuyama M; Kimura A
    Carbohydrate polymers, 146, 396, 401, 2016年08月01日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • A Solanum torvum GH3 β-glucosidase expressed in Pichia pastoris catalyzes the hydrolysis of furostanol glycoside.
    Suthangkornkul R; Sriworanun P; Nakai H; Okuyama M; Svasti J; Kimura A; Senapin S; Arthan D
    Phytochemistry, 127, 4, 11, 2016年07月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • α-Glucosidases and α-1,4-glucan lyases: structures, functions, and physiological actions.
    Okuyama M; Saburi W; Mori H; Kimura A
    Cellular and molecular life sciences : CMLS, 73, 14, 2727, 51, 2016年07月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural and biochemical studies of plant α-glucosidases with a series of long-chain inhibitors.
    Tagami T; Yamashita K; Okuyama M; Mori H; Yao M; Kimura A
    Bull Appl Glycosci, 6, 2, 103, 108, 2016年, ［査読有り］
    日本語, 研究論文（学術雑誌）
  • Megalo-type α-1,6-glucosaccharides induce production of tumor necrosis factor α in primary macrophages via toll-like receptor 4 signaling.
    Joe GH; Andoh M; Shinoki A; Lang W; Kumagai Y; Sadahiro J; Okuyama M; Kimura A; Shimizu H; Hara H; Ishizuka S
    Biomedical research (Tokyo, Japan), 37, 3, 179, 86, 2016年, ［査読有り］, ［国内誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Purification and characterization of a chloride ion-dependent α-glucosidase from the midgut gland of Japanese scallop (Patinopecten yessoensis).
    Masuda Y; Okuyama M; Iizuka T; Nakai H; Saburi W; Fukukawa T; Maneesan J; Tagami T; Naraoka T; Mori H; Kimura A
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 80, 3, 479, 85, 2016年, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • The loop structure of Actinomycete glycoside hydrolase family 5 mannanases governs substrate recognition.
    Yuya Kumagai; Keitaro Yamashita; Takayoshi Tagami; Misugi Uraji; Kun Wan; Masayuki Okuyama; Min Yao; Atsuo Kimura; Tadashi Hatanaka
    The FEBS journal, 282, 20, 4001, 14, 2015年10月, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural elements responsible for the glucosidic linkage-selectivity of a glycoside hydrolase family 13 exo-glucosidase.
    Wataru Saburi; Hiroaki Rachi-Otsuka; Hironori Hondoh; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura
    FEBS letters, 589, 7, 865, 9, 2015年03月24日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural insights into the catalytic reaction that is involved in the reorientation of Trp238 at the substrate-binding site in GH13 dextran glucosidase.
    Momoko Kobayashi; Wataru Saburi; Daichi Nakatsuka; Hironori Hondoh; Koji Kato; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura; Min Yao
    FEBS letters, 589, 4, 484, 9, 2015年02月13日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Extracellular and cell-associated forms of Gluconobacter oxydans dextran dextrinase change their localization depending on the cell growth.
    Juri Sadahiro; Haruhide Mori; Wataru Saburi; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    Biochemical and biophysical research communications, 456, 1, 500, 5, 2015年01月02日, ［査読有り］, ［国際誌］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Identity of the two dextran dextrinases produced by Gluconobacter oxydans ATCC 11894 and its localization change depending on the cell growth.
    Sadahiro J; Mori H; Saburi W; Okuyama M; Kimura A
    Biochem Biophys Res Commun, 456, 1, 500, 505, 2015年, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Biochemical properties and substrate recognition mechanism of GH31 α-glucosidase from Bacillus sp. AHU 2001 with broad substrate specificity.
    Saburi W; Okuyama M; Kumagai Y; Kimura A; Mori H
    Biochimie, 108, 140, 148, 2015年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural advantage of sugar beet α-glucosidase to stabilize the Michaelis complex with long-chain substrate.
    Tagami T; Yamashita K; Okuyama M; Mori H; Yao M; Kimura A
    The Journal of biological chemistry, 290, 3, 1796, 1803, 2015年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Different molecular complexity of linear-isomaltomegalosaccharides and β-cyclodextrin on enhancing solubility of azo dye ethyl red: towards dye biodegradation.
    Lang W; Kumagai Y; Sadahiro J; Maneesan J; Okuyama M; Mori H; Sakairi N; Kimura A
    Bioresource technology, 169, 518, 524, 2014年10月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Catalytic role of the calcium ion in GH97 inverting glycoside hydrolase
    Masayuki Okuyama; Takuya Yoshida; Hironori Hondoh; Haruhide Mori; Min Yao; Atsuo Kimura
    FEBS LETTERS, 588, 17, 3213, 3217, 2014年08月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Biodecolorization of a food azo dye by the deep sea Dermacoccus abyssi MT1.1(T) strain from the Mariana Trench
    Weeranuch Lang; Sarote Sirisansaneeyakul; Ligia O. Martins; Lukana Ngiwsara; Nobuo Sakairi; Wasu Pathom-aree; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura
    JOURNAL OF ENVIRONMENTAL MANAGEMENT, 132, 155, 164, 2014年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Characterization of a new oxygen-insensitive azoreductase from Brevibacillus laterosporus TISTR1911: Toward dye decolorization using a packed-bed metal affinity reactor
    Weeranuch Lang; Sarote Sirisansaneeyakul; Lukana Ngiwsara; Sonia Mendes; Ligia O. Martins; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    BIORESOURCE TECHNOLOGY, 150, 298, 306, 2013年12月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Replacement of the Catalytic Nucleophile Aspartyl Residue of Dextran Glucosidase by Cysteine Sulfinate Enhances Transglycosylation Activity
    Wataru Saburi; Momoko Kobayashi; Haruhide Mori; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 288, 44, 31670, 31677, 2013年11月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Aromatic residue on β→α loop 1 in the catalytic domain is important to the transglycosylation specificity of glycoside hydrolase family 31 α-glucosidase.
    Song KM; Okuyama M; Nishimura M; Tagami T; Mori H; Kimura A
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 77, 8, 1759, 1765, 2013年08月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Molecular basis for the recognition of long-chain substrates by plant α-glucosidases.
    Tagami T; Yamashita K; Okuyama M; Mori H; Yao M; Kimura A
    The Journal of biological chemistry, 288, 26, 19296, 19303, 2013年06月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Enzymatic Synthesis of Acarviosyl-maltooligosaccharides Using Disproportionating Enzyme 1
    Takayoshi Tagami; Yoshiyuki Tanaka; Haruhide Mori; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 77, 2, 312, 319, 2013年02月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Key aromatic residues at subsites +2 and +3 of glycoside hydrolase family 31 alpha-glucosidase contribute to recognition of long-chain substrates
    Takayoshi Tagami; Masayuki Okuyama; Hiroyuki Nakai; Young-Min Kim; Haruhide Mori; Kazunori Taguchi; Birte Svensson; Atsuo Kimura
    BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS, 1834, 1, 329, 335, 2013年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • A novel mechanism for the promotion of quercetin glycoside absorption by megalo α-1,6-glucosaccharide in the rat small intestine.
    Shinoki A; Lang W; Thawornkuno C; Kang HK; Kumagai Y; Okuyama M; Mori H; Kimura A; Ishizuka S; Hara H
    Food chemistry, 136, 2, 293, 296, 2013年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Key aromatic residues at subsites +2 and +3 of glycoside hydrolase family 31 α-glucosidase contribute to recognition of long-chain substrates.
    Tagami T; Okuyama M; Nakai H; Kim YM; Mori H; Taguchi K; Svensson B; Kimura A
    Biochimica et biophysica acta, 1834, 1, 329, 335, 2013年01月, ［査読有り］
  • Characterization of a glycoside hydrolase family 31 α-glucosidase involved in starch utilization in Podospora anserina.
    Song KM; Okuyama M; Kobayashi K; Mori H; Kimura A
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 77, 10, 2117, 2124, 2013年, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • The Delay in the Development of Experimental Colitis from Isomaltosyloligosaccharides in Rats Is Dependent on the Degree of Polymerization
    Hitoshi Iwaya; Jae-Sung Lee; Shinya Yamagishi; Aki Shinoki; Weeranuch Lang; Charin Thawornkuno; Hee-Kwon Kang; Yuya Kumagai; Shiho Suzuki; Shinichi Kitamura; Hiroshi Hara; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura; Satoshi Ishizuka
    PLOS ONE, 7, 11, e50658, 2012年11月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Amino acids in conserved region II are crucial to substrate specificity, reaction velocity, and regioselectivity in the transglucosylation of honeybee GH-13 α-glucosidases.
    Ngiwsara L; Iwai G; Tagami T; Sato N; Nakai H; Okuyama M; Mori H; Kimura A
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 76, 10, 1967, 1974, 2012年10月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 glycoside hydrolase family 66 homolog catalyzes dextranolytic and cyclization reactions
    Young-Min Kim; Eiji Yamamoto; Min-Sun Kang; Hiroyuki Nakai; Wataru Saburi; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Kazumi Funane; Mitsuru Momma; Zui Fujimoto; Mikihiko Kobayashi; Doman Kim; Atsuo Kimura
    FEBS JOURNAL, 279, 17, 3185, 3191, 2012年09月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural Elucidation of Dextran Degradation Mechanism by Streptococcus mutans Dextranase Belonging to Glycoside Hydrolase Family 66
    Nobuhiro Suzuki; Young-Min Kim; Zui Fujimoto; Mitsuru Momma; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Kazumi Funane; Atsuo Kimura
    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 287, 24, 19916, 19926, 2012年06月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Novel Dextranase Catalyzing Cycloisomaltooligosaccharide Formation and Identification of Catalytic Amino Acids and Their Functions Using Chemical Rescue Approach
    Young-Min Kim; Yoshiaki Kiso; Tomoe Muraki; Min-Sun Kang; Hiroyuki Nakai; Wataru Saburi; Weeranuch Lang; Hee-Kwon Kang; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Ryuichiro Suzuki; Kazumi Funane; Nobuhiro Suzuki; Mitsuru Momma; Zui Fujimoto; Tetsuya Oguma; Mikihiko Kobayashi; Doman Kim; Atsuo Kimura
    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 287, 24, 19927, 19935, 2012年06月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • A novel metabolic pathway for glucose production mediated by α-glucosidase-catalyzed conversion of 1,5-anhydrofructose.
    Kim YM; Saburi W; Yu S; Nakai H; Maneesan J; Kang MS; Chiba S; Kim D; Okuyama M; Mori H; Kimura A
    The Journal of biological chemistry, 287, 27, 22441, 22444, 2012年06月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Chemical constituents and free radical scavenging activity of corn pollen collected from Apis mellifera hives compared to floral corn pollen at Nan, Thailand
    Atip Chantarudee; Preecha Phuwapraisirisan; Kiyoshi Kimura; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura; Chanpen Chanchao
    BMC COMPLEMENTARY AND ALTERNATIVE MEDICINE, 12, 45, 2012年04月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • In vitro antiproliferative/cytotoxic activity on cancer cell lines of a cardanol and a cardol enriched from Thai Apis mellifera propolis
    Dungporn Teerasripreecha; Preecha Phuwapraisirisan; Songchan Puthong; Kiyoshi Kimura; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura; Chanpen Chanchao
    BMC COMPLEMENTARY AND ALTERNATIVE MEDICINE, 12, 27, 2012年03月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Degree of polymerization in dietary α-1,6-gluco¬sac¬cha¬rides modulates symptom of experimental colitis in rats.
    Iwaya H; Lee JS; Yamagishi S; Shinoki A; Lang W; Kang HK; Okuyama M; Mori H; Hara H; Kimura A; Ishizuka S
    Plos One, 7, 11, e50658, e50658, 2012年, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Characterization of some enzymatic properties of recombinant α-glucosidase III from the Thai honeybee, Apis cerana indica Fabricus.
    Kaewmuangmoon J; Yoshiyama M; Kimura K; Okuyama M; Mori H; Kimura A; Chanchao C
    Afr J Biotechnol, 11, 96, 16220, 16232, 2012年, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Function and structure studies of GH family 31 and 97 α-glycosidases.
    Okuyama M
    Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 75, 12, 2269, 2277, 2011年12月, ［査読有り］
    英語
  • Crystallization and preliminary crystallographic analysis of dextranase from Streptococcus mutans
    Nobuhiro Suzuki; Young-Min Kim; Zui Fujimoto; Mitsuru Momma; Hee-Kwon Kang; Kazumi Funane; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura
    ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION F-STRUCTURAL BIOLOGY COMMUNICATIONS, 67, Pt 12, 1542, 1544, 2011年12月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Calcium Ion-Dependent Increase in Thermostability of Dextran Glucosidase from Streptococcus mutans
    Momoko Kobayashi; Hironori Hondoh; Haruhide Mori; Wataru Saburi; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 75, 8, 1557, 1563, 2011年08月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Truncation of N- and C-terminal regions of Streptococcus mutans dextranase enhances catalytic activity
    Young-Min Kim; Ryoko Shimizu; Hiroyuki Nakai; Haruhide Mori; Masayuki Okuyama; Min-Sun Kang; Zui Fujimoto; Kazumi Funane; Doman Kim; Atsuo Kimura
    APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 91, 2, 329, 339, 2011年07月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • The first alpha-1,3-glucosidase from bacterial origin belonging to glycoside hydrolase family 31
    Min-Sun Kang; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura
    BIOCHIMIE, 91, 11-12, 1434, 1442, 2009年11月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Catalytic Reaction Mechanism Based on alpha-Secondary Deuterium Isotope Effects in Hydrolysis of Trehalose by European Honeybee Trehalase
    Haruhide Mori; Jin-Ha Lee; Masayuki Okuyama; Mamoru Nishimoto; Masao Ohguchi; Doman Kim; Atsuo Kimura; Seiya Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 73, 11, 2466, 2473, 2009年11月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Catalytic Mechanism of Retaining alpha-Galactosidase Belonging to Glycoside Hydrolase Family 97
    Masayuki Okuyama; Momoyo Kitamura; Hironori Hondoh; Min-Sun Kang; Haruhide Mori; Atsuo Kimura; Isao Tanaka; Min Yao
    JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 392, 5, 1232, 1241, 2009年10月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structure-function relationship of substrate length specificity of dextran glucosidase from Streptococcus mutans
    Wataru Saburi; Hironori Hondoh; Young-Min Kim; Haruhide Mori; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    BIOLOGIA, 63, 6, 1000, 1005, 2008年12月
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural and Functional Analysis of a Glycoside Hydrolase Family 97 Enzyme from Bacteroides thetaiotaomicron
    Momoyo Kitamura; Masayuki Okuyama; Fumiko Tanzawa; Haruhide Mori; Yu Kitago; Nobuhisa Watanabe; Atsuo Kimura; Isao Tanaka; Min Yao
    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 283, 52, 36328, 36337, 2008年12月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Molecular Mechanism of α-glucosidase
    Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Hironori Hondoh; Hiroyuki Nakai; Wataru Saburi; Min Sung Kang; Young Min Kim; Mamoru Nishimoto; Jintanart Wongchawalit; Takeshi Yamamoto; Mee Son; Jin Ha Lee; San San Mar; Kenji Fukuda; Seiya Chiba; Atsuo Kimura
    Carbohydrate-Active Enzymes: Structure, Function and Applications, 64, 76, 2008年09月, ［査読有り］
    論文集(書籍)内論文
  • Substrate recognition mechanism of alpha-1,6-glucosidic linkage hydrolyzing enzyme, dextran glucosidase from Streptococcus mutans
    Hironori Hondoh; Wataru Saburi; Haruhide Mori; Masayuki Okuyama; Toshitaka Nakada; Yoshiki Matsuura; Atsuo Kimura
    JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 378, 4, 913, 922, 2008年05月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Glycoside hydrolase family 31 Escherichia coli α-xylosidase.
    M-S. Kang; M. Okuyama; K. Yaoi; Y. Mitsuishi; Y-M. Kim; H. Mori; A. Kimura
    Biocatalysis and Biotransformation, 26, 1-2, 96, 103, 2008年
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Rice α-glucosidase isozymes and isoforms showing different starch granules-binding and -degrading ability
    Nakai H; Tanizawa S; Ito T; Kamiya K; Kim YM; Yamamoto T; Matsubara K; Sakai M; Sato H; Imbe T; Okuyama M; Mori H; Chiba S; Sano Y; Kimura A
    Biocatalysis and Biotransformation, 26, 1-2, 104, 110, 2008年, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Aglycone specificity of Escherichia coli alpha-xylosidase investigated by transxylosylation
    Min-Sun Kang; Masayuki Okuyama; Katsuro Yaoi; Yasushi Mitsuishi; Young-Min Kim; Haruhide Mori; Doman Kim; Atsuo Kimura
    FEBS JOURNAL, 274, 23, 6074, 6084, 2007年12月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Function-unknown glycoside hydrolase family 31 proteins, mRNAs of which were expressed in rice ripening and germinating stages, are alpha-glucosidase and alpha-xylosidase
    Hiroyuki Nakai; Shigeki Tanizawa; Tatsuya Ito; Koutarou Kamiya; Young-Min Kim; Takeshi Yamamoto; Kazuki Matsubara; Makoto Sakai; Hiroyuki Sato; Tokio Imbe; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Yoshio Sano; Seiya Chiba; Atsuo Kimura
    JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 142, 4, 491, 500, 2007年10月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Crystallization and preliminary X-ray analysis of Streptococcus mutans dextran glucosidase
    Wataru Saburi; Hironori Hondoh; Hideaki Unno; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Toshitaka Nakada; Yoshiki Matsuura; Atsuo Kimura
    ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION F-STRUCTURAL BIOLOGY AND CRYSTALLIZATION COMMUNICATIONS, 63, Pt 9, 774, 776, 2007年09月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Molecular cloning of cDNA for trehalase from the European honeybee, Apis mellifera L., and its heterologous expression in Pichia pastoris
    Jin-Ha Lee; Saori Saito; Haruhide Mori; Mamoru Nishimoto; Masayuki Okuyama; Doman Kim; Jintanart Wongchawalit; Atsuo Kimura; Seiya Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 71, 9, 2256, 2265, 2007年09月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Molecular cloning of cDNAs and genes for three alpha-glucosidases from European honeybees, Apis mellifera L., and heterologous production of recombinant enzymes in Pichia pastoris
    Mamoru Nishimoto; Haruhide Mori; Tsuneharu Moteki; Yukiko Takamura; Gaku Iwai; Yu Miyaguchi; Masayuki Okuyama; Jintanart Wongchawalit; Rudee Surarit; Jisnuson Svasti; Atsuo Kimura; Seiya Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 71, 7, 1703, 1716, 2007年07月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Multiple forms of alpha-glucosidase in rice seeds (Oryza sativa L., var Nipponbare)
    Hiroyuki Nakai; Tatsuya Ito; Masatoshi Hayashi; Koutarou Kamiya; Takeshi Yamamoto; Kazuki Matsubara; Young-Min Kim; Wongchawalit Jintanart; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Seiya Chiba; Yoshio Sano; Atsuo Kimura
    BIOCHIMIE, 89, 1, 49, 62, 2007年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Purification and characterization of alpha-glucosidase I from Japanese honeybee (Apis cerana japonica) and molecular cloning of its cDNA
    Jintanart Wongchawalit; Takeshi Yamamoto; Hiroyuki Nakai; Young-Min Kim; Natsuko Sato; Mamoru Nishimoto; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Osamu Saji; Chanpen Chanchao; Siriwat Wongsiri; Rudee Surarit; Jisnuson Svasti; Seiya Chiba; Atsuo Kimura
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 70, 12, 2889, 2898, 2006年12月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Plant α-glucosidase: Molecular analysis of rice α-glucosidase and degradation mechanism of starch granules in germination stage
    Nakai H; Ito T; Tanizawa S; Matsubara K; Yamamoto T; Okuyama M; Mori H; Chiba S; Sano Y; Kimura A
    Journal of Applied Glycoscience, 53, 2, 137, 142, The Japanese Society of Applied Glycoscience, 2006年07月, ［査読有り］
    英語, 植物種子が発芽する際に貯蔵物質である澱粉は，各種加水分解酵素により酵素分解され，生長に必要な物質・エネルギーの供給源となる．澱粉は植物種子中に不溶性の澱粉粒として存在するため，現在までα-アミラーゼが唯一澱粉粒に直接作用できる酵素であると考えられてきた．しかし，我々は植物α-グルコシダーゼが澱粉粒への吸着・分解能をもつことを明らかにし，第2の澱粉分解経路 (澱粉粒にα-グルコシダーゼが作用し，直接グルコースを遊離する経路) の存在を示した．さらに，植物α-グルコシダーゼには，触媒ドメインとは独立して機能する澱粉粒吸着ドメインがC末端に存在することを解明した．本ドメインに保存された芳香族アミノ酸に対する部位特異的変異導入により，澱粉粒吸着に関与する残基を推定した．植物種子中には，複数のα-グルコシダーゼが存在する．我々は，イネ種子中に可溶性および不溶性 (界面活性剤により可溶化が可能) の性質を示す2種のアイソザイムを見出した．両酵素の発現様式から，14品種のイネ種子を二つのグループ (グループ1，2) に大別した．グループ1は，不溶性酵素のみが乾燥種子に検出されるイネ品種である．不溶性α-グルコシダーゼが登熟期で合成され，完熟に伴い種子中に保存されるが，発芽の進行につれ消失する．発芽後に可溶性酵素が新たに合成される．グループ2の品種では，可溶性および不溶性の酵素が乾燥種子に検出された．両酵素は登熟期で合成され，発芽期間中の活性は変化せず，一定のレベルで推移する．グループ1からは赤米を，グループ2では日本晴を実験対象に選び，α-グルコシダーゼの機能解析を行った．翻訳後修飾やゲノム遺伝子発現調節によるアイソフォームやアイソザイムの形成機構ならびに精製酵素を用いた性質の解明を行った．多様なα-グルコシダーゼが関与する澱粉代謝の一端が明らかにされた．N末領域に生じる翻訳後限定分解は，植物酵素に対し一般的に観察される現象であった．
  • Structural elements to convert Escherichia coli alpha-xylosidase (YicI) into alpha-glucosidase
    M Okuyama; A Kaneko; H Mori; S Chiba; A Kimura
    FEBS LETTERS, 580, 11, 2707, 2711, 2006年05月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural elements in dextran glucosidase responsible for high specificity to long chain substrate
    Wataru Saburi; Haruhide Mori; Saori Saito; Masayuki Okuyama; Atsuo Kimura
    BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS, 1764, 4, 688, 698, 2006年04月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Structural elements in dextran glucosidase responsible for high specificity to long chain substrate.
    Saburi W; Mori H; Saito S; Okuyama M; Kimura A
    Biochimica et biophysica acta, 1764, 4, 688, 698, 2006年04月, ［査読有り］
  • Glucoamylase originating from Schwanniomyces occidentalis is a typical alpha-glucosidase
    F Sato; M Okuyama; H Nakai; H Mori; A Kimura; S Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 69, 10, 1905, 1913, 2005年10月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Crystallization and preliminary X-ray analysis of alpha-xylosidase from Escherichia coli
    M Kitamura; T Ose; M Okuyama; H Watanabe; M Yao; H Mori; A Kimura; Tanaka, I
    ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION F-STRUCTURAL BIOLOGY AND CRYSTALLIZATION COMMUNICATIONS, 61, Pt 2, 178, 179, 2005年02月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Enzymatic synthesis of alkyl alpha-2-deoxyglucosides by alkyl alcohol resistant alpha-glucosidase from Aspergillus niger
    YM Kim; M Okuyama; H Mori; H Nakai; W Saburi; S Chiba; A Kimura
    TETRAHEDRON-ASYMMETRY, 16, 2, 403, 409, 2005年01月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Molecular analysis of α-glucosidase belonging to GH-family 31
    Nakai H; Okuyama M; Kim YM; Saburi W; Wongchawalit J; Mori H; Chiba S; Kimura A
    Biologia, Bratislava, 60, 131, 135, 2005年, ［査読有り］
    英語
  • Nakai H., Okuyama M., Kim YM., Saburi W., Wongchawalit J., Mori H., Chiba S. and Kimura A. "Molecular analysis of alpha-glucosidase belonging to GH-family 31" Biologia 60: 131-135(2005)*
    2005年
  • Okuyama M., Tanimoto Y., Ito T., Anzai A., Mori H., Kimura A., Matsui H. and Chiba S. "Purification and characterization of the hyper-glycosylated extracellular alpha-glucosidase from Schizosaccharomyces pombe" Enzyme and Microbial Technol., 37:472-48・・・
    2005年
    Okuyama M., Tanimoto Y., Ito T., Anzai A., Mori H., Kimura A., Matsui H. and Chiba S. "Purification and characterization of the hyper-glycosylated extracellular alpha-glucosidase from Schizosaccharomyces pombe"

    Enzyme and Microbial Technol., 37:472-480(2005)*
  • KIM YM., Okuyama M., Mori H., Chiba S. and Kimura A.: "Enzymatic synthesis of alkyl alpha-2-deoxyglucosides by alkyl alcohol resistant alpha-glucosidase from Aspergillus niger", Tetrahedron-asymmetr. 16 403-409 (2005)*
    2005年
  • Localization of alpha-glucosidases I, II, and III in organs of European honeybees, Apis mellifera L., and the origin of alpha-glucosidase in honey
    M Kubota; M Tsuji; M Nishimoto; J Wongchawalit; M Okuyama; H Mori; H Matsui; R Surarit; J Svasti; A Kimura; S Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 68, 11, 2346, 2352, 2004年11月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Overexpression and characterization of two unknown proteins, YicI and YihQ, originated from Escherichia coli
    M Okuyama; H Mori; S Chiba; A Kimura
    PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, 37, 1, 170, 179, 2004年09月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Purification and characterization of Acremonium implicatum alpha-glucosidase having regioselectivity for alpha-1,3-glucosidic linkage
    T Yamamoto; T Unno; Y Watanabe; M Yamamoto; M Okuyama; H Mori; S Chiba; A Kimura
    BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS, 1700, 2, 189, 198, 2004年08月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Purification and characterization of Acremonium implicatum alpha-glucosidase having regioselectivity for alpha-1,3-glucosidic linkage.
    Yamamoto T; Unno T; Watanabe Y; Yamamoto M; Okuyama M; Mori H; Chiba S; Kimura A
    Biochimica et biophysica acta, 1700, 2, 189, 198, 2004年08月, ［査読有り］
  • Purification, characterization, and sequence analysis of two alpha-amylase isoforms from azuki bean, Vigna angularis, showing different affinity towards beta-cyclodextrin sepharose
    SS Mar; H Mori; JH Lee; K Fukuda; W Saburi; A Fukuhara; M Okuyama; S Chiba; A Kimura
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 67, 5, 1080, 1093, 2003年05月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Evidence of Intramolecular Transglucosylation Catalyzed by an α-Glucosidase
    孫 美; 森 春英; 奥山 正幸; 木村 淳夫; 千葉 誠哉
    J. Appl. Glycosci., 50:41-44(2003)*, 50, 1, 41, 44, The Japanese Society of Applied Glycoscience, 2003年
    英語, 炭水化物加水分解酵素の水解反応は,その逆反応(縮合反応)が必然的に伴った反応である.従って,水解され得る基質のみが逆反応によって生成される.ミツバチα-グルコシダーゼI は,イソマルトースを全く水解できないが,他の二糖マルトース,コジビオースを水解できる.わずかではあるが,ニゲロースをも水解する.しかしながら,本酵素は高濃度のグルコースから逆反応によってマルトース,コジビオースおよびニゲロースと共にイソマルトースをも生成した.このような事実は,本酵素がイソマルトースに対して水解作用をもたないという知見と矛盾している.この特異な現象に関する矛盾の解析が試みられた.その結果,本来,グルコースから逆反応によってイソマルトースが直接生成されることはあり得ないことであるが,逆反応によって容易に生成され得るマルトースやコジビオース等の他の二糖からの分子内糖転移反応によってイソマルトースへ変換されイソマルトースが生成されると推定された.炭水化物水解酵素の反応において,通常の糖転移反応と考えられている反応には,上述のような分子内転移反応が同時に起こっていることが示唆された.
  • Son, M., Mori, H., Okuyama, M., Kimura A. and Chiba, S.:" Evidence of Intramolecular Transglucosylation Catalyzed by an alpha-Glucosidase", Journal of Applied Glycoscience, 50: 41-44(2003)*
    2003年
  • Identification of essential ionizable groups and evaluation of subsite affinities in the active site of beta-D-glucosidase F-1 from a Streptomyces sp.
    K Fukuda; H Mori; M Okuyama; A Kimura; H Ozaki; M Yoneyama; S Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 66, 10, 2060, 2067, 2002年10月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Streptomyces sp. β-_D-グルコシダーゼF_1の基質特異性および活性部位に関する反応速度論的解析
    福田 健二; 白川 康; 森 春英; 奥山 正幸; 木村 淳夫; 尾崎 八郎; 米山 道男; 千葉 誠哉
    応用糖質科学 : oyo toshitsu kagaku = Journal of applied glycoscience, 49, 3, 265, 272, 日本応用糖質科学会, 2002年07月18日
    英語, Streptomyces sp.から精製したβ-D-グルコシダーゼF1(分子量、50,O00;最適pH、5.5)の基質特異性と活性部位について反応速度論的な検討を行った。本酵素は、β-グルコシド結合からなる各種の合成基質や二糖に対し広い基質特異性を示したが、二糖よりも合成基質に対し高い特異性を示した。合成基質ではp-ニトロフェニルβ-グルコシド(Km,0.72mM;k0,63s-1)よりもp-ニトロフェニルβ-フコシド(Km,O.19mM;k0,44s-1)が、二糖ではセロビオースよりもラミナリビオース(Km,1.6mM;k0,70s-1)が加水分解の反応効率からみてより優れた基質と考えられた。P-ニトロフェニルβ-グルコシド(PNPG)、β-フコシド(PNPF)およびβ-ガラクトシド(PNPGal)が共通の活性部位で加水分解されるか否かについて、混合基質を用いた反応系において速度論的解析を行った。PNPGとPNPF(またはPNPGal)の混合基質の加水分解におけるいくつかの速度論的特徴、特にLineweaver-Burkプロットの直線性、あるいはPNPGの他基質に対するモル分率(f),f=[PNPG]/([PNPG]+[PNPFまたはPNPGal])の最大速度とミカエリス定数への依存性の実験値は単一触媒部位機構において理論的に予測される値によく一致した。これらの実験結果は、...
  • alpha-glucosidase mutant catalyzes "alpha-glycosynthase"-type reaction
    M Okuyama; H Mori; K Watanabe; A Kimura; S Chiba
    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 66, 4, 928, 933, 2002年04月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp.
    FUKUDA K; SHIRAKAWA K; MORI H; OKUYAMA M; KIMURA A; OZAKI H; YONEYAMA M; CHIBA S
    J. Appl. Glycosci., 49, 3, 265, 272, 2002年
  • Fukuda, K., Shirakawa, K., Mori, H., Okuyama, M., Kimura, A., Ozaki H., Yoneyama, M. and Chiba, S. "Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp.", Journal of Applied Glycoscience, 49, 265-272(2002)
    2002年
  • Purification and identification of the essential ionizable groups of honeybee, Apis mellifera L., trehalase
    Jin-Ha Lee; Masahisa Tsuji; Mitsuru Nakamura; Mamoru Nishimoto; Masayuki Okuyama; Haruhide Mori; Atsuo Kimura; Hirokazu Matsui; Seiya Chiba
    Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 65, 12, 2657, 2665, 2001年12月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • Carboxyl group of residue Asp647 as possible proton donor in catalytic reaction of alpha-glucosidase from Schizosaccharomyces pombe
    M Okuyama; A Okuno; N Shimizu; H Mori; A Kimura; S Chiba
    EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 268, 8, 2270, 2280, 2001年04月, ［査読有り］
    英語, 研究論文（学術雑誌）
  • 酵母α-グルコシダーゼの存在部位の解析
    佐伯 雄史; 奥山 正幸; 森 春英; 木村 淳夫; 千葉 誠哉
    応用糖質科学 : oyo toshitsu kagaku = Journal of applied glycoscience, 45, 3, 281, 283, 日本応用糖質科学会, 1998年08月31日
    英語
■ その他活動・業績
■ 講演・口頭発表等
  • Discovery of α-L-glucosidase in nature
    Masayuki Okuyama; Hye-jin Kang; Rikako Shishiuchi; Takayoshi Tagami
    3rd Japan-Switzerland-Germany Workshop on Biocatalysis and Bioprocess Development, 2023年10月11日, 英語, 口頭発表（一般）
    2023年10月10日 - 2023年10月12日
  • 糖質加水分解酵素ファミリー97における触媒機構と多様性
    奥山 正幸
    日本農芸化学会2015年度岡山大会, 2015年03月29日, 日本語, シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
    ［招待講演］, ［国内会議］
■ 主な担当授業
  • 大学院共通授業科目（一般科目）：自然科学・応用科学, 2024年, 修士課程, 大学院共通科目
  • バイオテクノロジー学特論, 2024年, 修士課程, 農学院
  • バイオテクノロジー学特論演習, 2024年, 修士課程, 農学院
  • 応用分子生物学特論, 2024年, 修士課程, 農学院
  • 応用分子生物学特論演習, 2024年, 修士課程, 農学院
  • 実践農学総論, 2024年, 修士課程, 農学院
  • 分子酵素学, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 卒業論文, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 応用生命科学演習Ⅱ, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 応用生命科学演習Ⅲ, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 応用生命科学演習Ⅳ, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 生物学Ⅰ, 2024年, 学士課程, 全学教育
  • 応用生命科学実験, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 応用生命科学概論, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 基礎分子生物学, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 応用生命科学演習Ⅰ, 2024年, 学士課程, 農学部
  • 生物学実験, 2024年, 学士課程, 農学部
■ 所属学協会
  • 日本農芸化学会
  • 日本応用糖質科学会
■ Works（作品等）
  • 「Glycoside hydrolase family 31酵素の構造と機能」、日本農芸化学会平成17年度大会シンポジウム－糖質酵素の最先端研究を担う若きサイエンティストの視点－
    2005年
  • 「glycosidase変異酵素が触媒するglycosynthase反応」, 『第29回糖質科学懇話会』
■ 共同研究・競争的資金等の研究課題
  • 難溶性BCS II化合物を水溶化する新奇メガロ糖を活用した問題解決型研究
    科学研究費助成事業 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))
    2019年10月 - 2023年03月
    木村 淳夫; 橋床 泰之; 崎浜 靖子; 奥山 正幸; 田上 貴祥
    我々は世界で初めてメガロ糖（MS）の生産に成功した。性質を調べると、BCS IIに属す化合物（難水溶性・高膜透過性の薬剤や食品素材など）を可溶化する画期的な機能が発見された。またMSは「BCS II化合物を溶質とする糖質水溶化剤」と捉えることもできた。一方、難溶性ベンジル系アゾ色素もBCS IIに属し、かつ「東南アジア諸国における名高い環境汚染物質」である点に注目し、MSとアゾ分解酵素を組合せることで、実験室レベルではあるが、色素の可溶化と酵素分解に成功した。以上は初めて生産したMS、すなわち従来型MSの知見である。極最近に従来型MSより高機能な新奇MS（新型MS）を発見した。本申請では、新型MSによるアゾ色素の酵素分解を目的とし、現地試験をタイで実施する。最終的な到達目標はアゾ色素の汚染解消（すなわち環境問題解決への貢献）である。
    本年度は、新型コロナウイルス感染症の流行および相手国の政情不安から渡航が困難となり、現地調査に大きな支障が生じ、計画の遂行に予想外の大きな遅れが発生した。本状況下で得られた成果を述べる。多糖選抜および新型MS調製の項目に関し、昨年度に行った研究計画上の工夫（調査が不可な期間は、日タイ共通植物種を対象に研究を先行。渡タイ可能時に現地で結果検証）により研究を進めた。共通植物種から取得したMSが示すBCS II化合物の可溶化能を測定し、優れた能力を有する新奇MSを見出した。さらに調査対象の植物種を増やし、多糖調製・MS分離・構造と機能の解析を継続している。なお、現地で実施が必要なMS高機能化および色素汚染解消に関する計画に大幅な遅延が生じているが、渡航開始後に打開を目指したい。
    日本学術振興会, 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B)), 北海道大学, 研究分担者, 19KK0147
  • メガロ糖研究の新展開：優れた機能を発揮する新しいメガロ糖の構築とその応用
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    2017年04月 - 2021年03月
    木村 淳夫; 田上 貴祥; 奥山 正幸
    我々は初めてメガロ糖を酵素生産し、難溶性化合物を可溶化する機能を見出した。しかしながら、我々のメガロ糖研究の歴史は浅く、解決すべき課題が山積する。本研究の目的は、それらの中で重要な３課題について打開を図るとともに、基礎知見を取得し、応用進展させることである。すなわち、１）メガロ糖生産を可能にした多糖合成酵素の分子機構究明、２）より高機能な新しいメガロ糖の構築、３）メガロ糖を用いたアゾ色素汚染の改善である。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 研究分担者, 17H03801
  • 自然界におけるL-グルコシド分解酵素の探索と機能性未知L-オリゴ糖の合成
    科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
    2018年06月 - 2020年03月
    奥山 正幸
    天然の多くの糖質はD体により構成されているが，L体の単糖ならびにオリゴ糖が存在していても理論的にはおかしくないという背景のもと研究を開始した．既存酵素に新しいL-グリコシドに対する特異性を発見し，また新奇L-グリコシド特異性を有する酵素を配列データベースより取得することに成功した．またこれらL-グリコシダーゼを用いたL体の糖質からなるオリゴ糖や，D体とL体が混在したオリゴ糖を合成することができた．
    日本学術振興会, 挑戦的研究(萌芽), 北海道大学, 研究代表者, 18K19159
  • 糖質酵素が示す糖転移反応を支配する新規な構造因子の分子機構の究明と応用
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    2014年04月 - 2017年03月
    木村 淳夫; 奥山 正幸
    本研究の目的は、糖質酵素が示すオリゴ糖の合成反応（糖転移作用）を支配・向上できる新しい４つの現象を解析し、本反応の分子機構を知り、応用研究に結びつけることにある。以下に得られた成果を述べる。１）新奇なα-1,3-グルコシド転移酵素においてα-1,3転移を担う構造因子を確定した。２）触媒残基の変異酵素に見出された高転移活性に関して反応機構を調べ、強い転移能を有する変異体を取得した。３）活性部位にある細孔の分子解析を行い、触媒水の供給機能があることを推定した。４）多糖合成酵素が示すオリゴ糖合成に関与する構造因子を決定した。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 研究分担者, 26292049
  • 酵素による新しい糖質活性化法とこれを用いた配糖体合成システムの開発
    科学研究費補助金(基盤研究(C))
    2014年 - 2016年
    奥山 正幸
    本研究の目的は糖質加水分解酵素が触媒する糖転移反応における糖供与体を酵素反応により合成することである．β-フルクトフラノシダーゼやレバンスクラーゼを用い，スクロースのフラクトシル基を，キシロース，ガラクトース，マンノース，イソマルトオリゴ糖，マルトオリゴ糖，グルクロン酸に転移させることに成功した．これらは各種糖質加水分解酵素の糖供与体となり得るものである．また，各種糖質加水分解酵素を分子解析することにより，これらの糖転移反応の特異性ならびに特異性の改変を行った．また得られたフルクトシル糖を基質として，スクロースシンターゼを用い糖ヌクレオチドの合成に成功した．
    文部科学省, 基盤研究(C), 北海道大学, 研究代表者, 競争的資金, 26450114
  • 小胞体局在グルコシダーゼIIとその類縁酵素の基質認識機構の解明とその応用
    科学研究費補助金(若手研究(B))
    2010年 - 2011年
    奥山 正幸
    本研究の目的は生物全般に分布するα-グルコシダーゼ酵素群の基質特異性の分子進化を明らかとすることである。小胞体内でα-1, 3-グルコシドを加水分解する役割をもつ酵素が、α-1, 4結合にも作用することを明らかとした。植物種子に局在するα-グルコシダーゼでは活性中心の外側を覆うループ構造が特異性に関与していた。酵母α-グルコシダーゼ活性ポケットのTrp残基が基質特異性に関与していた。α-1, 3結合に特異性を示す細菌由来の新しい.-グルコシダーゼを発見した。本研究の結果から対象とした類縁酵素群は元来α-1, 3結合に特異性を示す同一祖先が分子進化により様々な特異性を獲得していることが示唆された。また類縁酵素内には新規機能を持つタンパク質がまだまだ埋もれていることが示唆された。
    文部科学省, 若手研究(B), 北海道大学, 研究代表者, 競争的資金, 22780082
  • 糖転移作用を支配する構造因子の分子解析と応用
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    2008年 - 2010年
    木村 淳夫; 奥山 正幸
    多糖などの糖質を加水分解する糖質酵素は、オリゴ糖の製造に利用される(オリゴ糖をヒトが食すると生理機能が向上)。興味深いことに、糖質酵素の種類によりオリゴ糖の生産能が異なり、糖質酵素の構造に起因する現象である。本研究では我々が見出した3つの現象から「オリゴ糖生産性の向上」を目指した。本研究の成果は、1)オリゴ糖生成に関与する構造因子(酵素機能を発揮させる部分構造)を解明、2)オリゴ糖の生産量・種類を制御する理論を形成、3)将来において酵素的オリゴ糖生産のオーダーメイド化を実現可能にする結果取得、である。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 20380056
  • 1残基のアミノ酸置換で「糖質分解酵素を多糖合成酵素に変換」する現象の分子機構
    科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究
    2008年 - 2009年
    木村 淳夫; 森 春英; 奥山 正幸
    1残基のアミノ酸置換で「多糖の加水分解酵素(デキストラナーゼ)を合成酵素に転換できる現象」を見出した。この反応機構を分子解析することが、本申請の目的である。このような合成反応は例がなく、世界で初めての現象である。また、産業利用への発展にも期待したい。この残基は触媒アミノ酸と考えられる。本現象は試験管内の観察であるが、このような点突然変異した酵素が実際に生物で機能している可能性を得た。進化の過程においてアミノ酸置換は容易に生じ、1つのアミノ酸を変異させることで酵素分子を「加水分解→合成」にする戦略は、進化的に効率が良い。この戦略の検証も本申請の目的である。本年度は次の結果を得た。多糖合成の分子解析(デキストラナーゼ):1)酵素の結晶化と立体構造解析:昨年度に大量精製した親酵素とGly置換体を用いて結晶化条件を検討した。良好な結晶化条件を確定でき、X線構造解析を進行中である。2)他のアミノ酸による変異酵素:Asp→Gly置換体が合成反応を示したが、より効率の良いアミノ酸置換も想定されたため、他の残基への点変異を試みた。その結果、Gly置換体が最も高い反応効率を与えた。Glyは最もサイズの小さな残基であり、Asp→Gly置換で生じた大きな空間が重要と考えられた。すなわち、このサイズの大きい空間に陰イオンが侵入し合成反応が進行したと考えられた。3)陰イオンの解析:アザイドイオンが最も反応効率の良い陰イオンであった。従って本イオンのサイズ・強度が合成反応に最適であることが分かった。反応の至適pHを確定でき、pK_a値に大きな変化がないと予想できた。4)生成物の構造解析:生成多糖はデキストラン様の構造であった。触媒残基の変異酵素の解析(ウニ酵素):5)遺伝子の発現:酵素遺伝子の異種宿主発現を行った。酵素蛋白質は封入体を形成せず発現しているが、塩存在下であっても酵素活性が極めて低かった。
    日本学術振興会, 挑戦的萌芽研究, 北海道大学, 20658025
  • 糖質加水分解酵素の触媒メカニズムの改変
    科学研究費補助金(若手研究(B))
    2008年 - 2009年
    奥山 正幸
    アミノ酸配列・立体構造の類似した糖質加水分解酵素が異なる触媒機構を示す原因を立体構造解析・部位特異的変異酵素の解析により明らかにした.触媒機構の保持型酵素と反転型機構の相互変換することを試みた。しかし活性を有する変異酵素を得ることをできなかった.この結果は進化の過程のかなり早い段階で触媒残基の置換が起こり,さらに二つの触媒機構を有する酵素群は分子進化してきているものと考えることができた.
    文部科学省, 若手研究(B), 北海道大学, 研究代表者, 競争的資金, 20780068
  • 異なる反応を示す糖質酵素の新規な立体構造に基づく分子解析と応用
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    2005年 - 2007年
    木村 淳夫; 森 春英; 奥山 正幸
    近年の糖質酵素の分類は、構造の類似性からなされる。研究対象は、α-グルコシダーゼと相同する酵素グループであり、産業界で重要な酵素が属する。すなわちα-グルコシダーゼ、グルカンリアーゼ、環状4糖合成酵素とα-キシロシダーゼであり、4つの反応(加水分解・糖転移・環状化・脱離反応)を触媒する。 本研究の目的は、我々が解析した本グループの立体構造に基づき、多様な反応の分子機構を明らかにし、得られた知見を応用研究に結びつけることにある。具体的には、X線解析法で得られた酵素-基質の分子認識を検討し、基質とアミノ酸の相互作用を解明;触媒アミノ酸の置換酵素の反応を解析し、触媒残基の機能を究明;4酵素は構造が類似するが全く異なる作用を示すので、個々の反応を発揮させる構造因子を解明;得られた知見から産業に重要な酵素を作製、である。
    本研究で得られた成果を述べる。(1)酵素-基質の立体構造から、α-キシロシダーゼの反応に重要なアミノ酸残基を予想した。その予想に基づいたアミノ酸置換をα-キシロシダーゼに行い、α-キシロシダーゼ活性を消失させ、α-グルコシダーゼ活性を発現させることに成功した。(2)解離型とプロトン化型の触媒基を決定し、機能を究明した(中間体安定とグルコシド結合切断)。(3)転移環状化と脱離反応の2つの作用は、反応中間体に水分子が攻撃(加水分解)しないことで生じると仮定し、加水分解型の酵素であるα-グルコシダーゼの触媒水(水解反応の水分子)を除去するようなアミノ酸変異を導入した。変異酵素は加水分解活性を失い転移作用のみを示すことが認められ、転移環状化と脱離の反応機構に関し初発ステップを実証できた。残り半分[分子内転移(環状化)と基質C2水素の引抜(脱離)]の解析が期待される。(4)α-グルコシダーゼのサブサイト+1にあるアミノ酸に変異導入すると、糖転移の結合生成能が変わり、新規な転移能力を示す酵素が得られた。有用なオリゴ糖の調製に成功した。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 17380060
  • 基質認識に基づいた特異性の高い自殺基質の分子設計
    科学研究費補助金(若手研究(B))
    2005年 - 2006年
    奥山 正幸
    構造プロテオミクス、プロテオーム解析など網羅的なタンパク質の機能解析の一方で、各論的な分子機能解析も今後の重要な課題となる。本研究の目的は分子機能解析の一環としての自殺基質を用いた糖質関連酵素の活性中心の一般的な探索法の開発である。自殺基質(EAG)は、酵素が基質を認識する機構を考慮した糖分子と反応基にはカルボキシ基と反応性の高いエポキシ環を用い、これら二つの分子群の距離をアルキル基鎖長を増減することで調節し、より特異性の高い自殺基質を設計した。酵素失活の分子機構解析に関しては失活が自殺基質的であることを反応動力学的に実証した。応用例も開発した。1.自殺基質の失活反応の解析;自殺基質の効果を解析するモデル酵素としてisomalto-dextranaseを用いた。アルキル基の長さ(炭素数3-6)が異なる自殺基質(E3G〜E6G)を混合し阻害効果を調べた。各自殺基質(EAG)濃度で失活の擬一次速度定数を求め、EAG濃度に対して擬一次速度定数をプロットすると両者の関係は直線ではなく飽和曲線となりMichaelis-Menten型の失活反応を示すことがわかった。すなわち失活はメカニカルベースであることがわかった。またE5Gの二次速度定数は他のEAGの6倍から10倍高くなっており、アルキル基の鎖長が自殺基質としての能力に重要なファクターであることがわかった。2.EAGを用いたα-amylase活性の特異的測定法;EAG利用の応用として生物試料破砕液からα-amylase活性を特異的に測定する方法の開発を試みた。β-amylase阻害剤E4Gとα-glucosidase阻害剤CBEをα-amylase:β-amylase:α-glucosidase混液と混合し後者二酵素を特異的に失活させ、α-amylaseのみの活性測定に成功した。このことは酵素を精製することなく粗酵素液中などで特定の酵素を失活させることができること示している。またこの結果は標識した自殺基質を用いて修飾後、ペプチドマスフィンガープリントなどにより、粗酵素液でも特定の酵素の活性中心のアミノ酸配列を知ることができるツールに成り得る可能性を示している。3.自殺基質との複合体立体構造の解析については期間内に解析を完了することはできなかった。現在も引き続き進行中である。
    文部科学省, 若手研究(B), 北海道大学, 研究代表者, 競争的資金, 17780072
  • アジア原産ミツバチのショ糖分解酵素の分子機構に関する調査
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    2004年 - 2005年
    木村 淳夫; 森 春英; 奥山 正幸
    我々は、西洋ミツバチを対象に蜂蜜生成のキー酵素であるショ糖分解酵素(α-グルコシダーゼ)を研究してきた。その理由は「蜂蜜の生成が極度に高い基質濃度・生成物濃度(85%)の条件」で行われるからである。その結果、異常な反応条件に適応した3つの酵素を見出した。研究の最終の到達地点は、1)ミツバチ属における蜂蜜生成の分子機構を究明、2)活性化を招くアロステリック構造を決定、である。しかし、蛋白構造の比較対象がないため作業は難航しており、アジア原産ミツバチの酵素データに期待している。本申請の目的は、タイ・韓国の4種ミツバチについて、A)基質・生成物-活性化型のアロステリック酵素が存在すること;B)各ミツバチ種が行う蜂蜜の生成機構の特徴を比較;C)アイソザイム発現に時空間制御があることの確認、を調査することである。
    アジア原産ミツバチは、西洋ミツバチと同様に3酵素あるは2酵素が存在することを調査できた。特に、東洋ミツバチについては3つの酵素をクロマト操作により分離に成功し、アロステリック酵素の照合(基質に対する活性化から判定)を行った。現在は活性化の分子解析を計画している。これらの3アイソザイムの発現に関し、時空間制御を示唆する結果を得た。小ミツバチにも基質活性化型酵素とさらにもう2種の酵素を確認できた。両ミツバチの蜂蜜にも活性があり、東洋ミツバチでは成虫酵素の1つと一致するデータを得た。クロ小ミツバチと大ミツバチの蜂蜜中にも活性があり、成虫酵素との照合を行った。これらには2種の酵素が存在する可能性が高い。本調査の解析から3アイソザイム系と2アイソザイム系の2タイプに分類できる結果を得た。本研究とは別個に行ったマル花バチの実験では2アイソザイム系を支持し、さらなる解析を行うことは花バチのショ糖分解システムの究明に重要である。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 16405025
  • 触媒アミノ酸を置換した酵素が、発揮する新たな機能とその応用
    科学研究費助成事業 萌芽研究
    2004年 - 2005年
    木村 淳夫; 森 春英; 奥山 正幸
    糖質の加水分解酵素は、2つの酸性アミノ酸(AspやGlu)を触媒残基とし、それぞれが-COO^-と-COOHの荷電状態を形成し、協奏的に加水分解を触媒する。応用性の高い糖転移作用も示すが、分解と転移は2つの酸性アミノ酸でなされ分割できない。最近、α-グルコシダーゼにある-COO^-型の触媒基であるAspをCysに置換した。本酵素(Asp→Cys)には活性はないが、温和な酸化で活性を発揮した。Cysの-SHが酸化され-SOOHとなり、活性中心内で-SOO^-に解離し-COO^-の代わりを行うと考えている。この酵素は分解能を失い、糖転移能が上昇し95%の収率を与えた。本研究の目的は、-SOO^-酵素に見出された「非分解・高転移」の現象を解析することである。具体的には、1)酸化したCys残基の構造決定、2)糖転移反応の解析、3)他の酵素を合成酵素にする先駆けとして、触媒基を-SOO^-にした糖質酵素の構築と機帯解析、である。計画は順調に進行し、1)と2)が完了した。本年度は、この現象の応用を図るために3)の課題を中心に研究を進行させた。レバン合成酵素とキチン分解酵素を取り上げ、触媒残基をCysに置換し、酸化処理を行った。両酵素のCys変異体には活性がなかったが、穏やかな酸化により活性が回復した。導入したSH基が-SOOHに変化したことを確認した。Cys酸化酵素は、親酵素と異なる性質を示した(レバン合成酵素:至適pHや転移作用の変化、キチン分解酵素:至適pHや協同性の変化)。
    日本学術振興会, 萌芽研究, 北海道大学, 16658136
  • 触媒アミノ酸の変異により新しい機能を獲得したグリコシラーゼの研究
    科学研究費助成事業 基盤研究(B)
    2002年 - 2004年
    木村 淳夫; 森 春英; 奥山 正幸; 玖村 朗人
    グリコシラーゼは糖質のグリコシド結合を加水分解する酵素の総称である。これらの酵素は加水分解の他に、基質のグリコシド残基をアクセプターに転移する反応(糖転移反応)を示す。転移反応は応用性が高く、i)清涼飲料水などの食品に含まれる機能性オリゴ糖の生産やii)多彩な生理活性をもつ複合糖鎖の合成に利用されている。しかし、加水分解と糖転移反応は切り離すことはできず、同時に進行する。従って、転移糖の生成条件であっても基質の加水分解が行われ、かつ、転移反応の生成物も分解されてしまう。我々は、グリコシラーゼの構造と機能を解析してきた。この研究過程で糖転移反応のみを抽出できる現象を見出した。本課題の目的は、本現象の機構を分子解析し応用に結びつけることであり、成果を以下に示す。1)対象としたグリコシラーゼについて自殺基質の手法で求核残基を推定後、本残基の点置換酵素(合成酵素)を発現・精製した。フルオライド基質について合成法を確立させ、大量調製を行った。得られた合成酵素は、いずれも分解活性を示さず、フルオライド基質とアクセプター基質を合成させる反応のみを行った。合成の至適pHはアルカリ側へシフトし、本現象は一般的に観察された。アクセプター特異性を調べたところ、アリールなどの疎水基を有する合成配糖体が最も高い収率を与えた。これは、サブサイト+2による疎水グループへの認識能が高いことを意味している。2)「歪み発生のアミノ酸変異酵素」を作製・精製・性質解析を行い、オリゴ糖合成試験を行った。収率が低いことが判明したので、反応条件を検討し、基質濃度の変化に効果を認めた。また、有機溶媒の添加も有効であったが、高濃度では活性低下が生じた。有機溶媒に耐性な糖質分解酵素が得られているので、これを歪み発生型酵素にするような発展研究を行いたい。
    日本学術振興会, 基盤研究(B), 北海道大学, 14360043
■ 産業財産権
  • デキストラン生成酵素遺伝子、デキストラン生成酵素およびその製造方法、デキストランの製造方法
    特許権
    特許公開２００７－１８１４５２
■ 学術・社会貢献活動／その他
社会貢献活動
  • 北海道旭川西高等学校SSH
    2010年 - 現在
    講師, 運営参加・支援
  • 北海道札幌藻岩高校環境講座
    2016年09月
    講師